時(shí)間：2023-05-30 10:06:43
開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創(chuàng)造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇纖維素酶，希望這些內(nèi)容能成為您創(chuàng)作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進(jìn)步。
纖維素是煙草中主要的細(xì)胞壁物質(zhì)，其含量高低直接影響煙葉的品質(zhì)。低等級(jí)煙葉由于纖維素含量較高，其煙氣會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的刺激性、嗆咳、澀口、枯焦氣［1］，因此，測定煙草中的纖維素，對(duì)于評(píng)價(jià)煙葉品質(zhì)具有重要意義。傳統(tǒng)的測定方法主要采用稀酸、稀堿與樣品依次共煮后用有機(jī)溶劑處理，再經(jīng)烘干后稱重［2-4］，這種方法操作繁瑣，費(fèi)力耗時(shí)，且由于操作人員的技術(shù)差異會(huì)帶來很大的誤差。近年來，近紅外（NIR）光譜分析技術(shù)也被用于煙草中纖維素含量的測定［5］，但是因其數(shù)據(jù)模型的建立需要大量的數(shù)據(jù)支撐，其應(yīng)用受到一定的局限。根據(jù)纖維素水解后生成葡萄糖的性質(zhì)，采用酶解纖維素得到葡萄糖［6-7］，然后利用流動(dòng)分析儀檢測還原糖含量［8］，可計(jì)算得到纖維素的含量，而且酶水解具有專一性和高效性［9-10］，流動(dòng)分析儀在行業(yè)內(nèi)的應(yīng)用也比較廣泛，因此，建立測定煙草中纖維素含量的流動(dòng)分析法，可為評(píng)價(jià)煙葉的品質(zhì)提供技術(shù)支持。
1材料與方法
1.1材料、試劑與儀器2009年初烤煙葉樣品17個(gè)（川渝中煙工業(yè)公司提供）。冰醋酸、檸檬酸、檸檬酸三鈉（AR，重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠）；葡萄糖、氯化鈣、氫氧化鈉（AR，重慶北碚化學(xué)試劑廠）；纖維素酶（BR，活力>15000DU，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；聚乙氧基月桂醚、對(duì)羥基苯甲酸酰肼（AR，荷蘭Skalar公司）。SkalarSan++流動(dòng)分析儀（荷蘭Skalar公司）；AX504分析天平（感量：0.0001g，瑞士MettlerToledo公司）；恒溫?fù)u床（中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠）；循環(huán)水真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；G3玻璃砂心漏斗（長春市玻璃儀器廠）。
1.2樣品處理和分析準(zhǔn)確稱取0.25g40目煙粉，置于100mL錐形瓶中，加入25mL5%醋酸溶液，搖床振蕩萃取30min，萃取出樣品本身含有的水溶性糖［8］，用G3漏斗過濾，濾渣用蒸餾水沖洗3次，每次50mL；將濾渣轉(zhuǎn)移到100mL錐形瓶中，加入60mL含有0.25g纖維素酶的檸檬酸/檸檬酸三鈉緩沖溶液（pH4.7）［7，11］，然后放入37℃恒溫?fù)u床水解24h；水解結(jié)束后將樣品冷卻至室溫，過濾，用蒸餾水將濾液定容至100mL，利用流動(dòng)分析儀測定樣品液中的葡萄糖，測得葡萄糖含量乘以轉(zhuǎn)換系數(shù)0.9（由纖維素水解方程式計(jì)算得到）即得纖維素含量。
2結(jié)果與討論
2.1酶解條件的選擇
2.1.1緩沖溶液用量對(duì)纖維素水解的影響準(zhǔn)確稱取0.25g煙粉樣品5份，按照1.2的方法除水溶性糖，然后分別加入固定纖維素酶量（0.25g纖維素酶）的緩沖溶液40，50，60，70，80mL，在固定溫度（37℃）條件下水解24h，纖維素含量的測定結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著緩沖液體積的增大，纖維素測定量也逐漸升高，當(dāng)緩沖溶液用量為60mL時(shí)，達(dá)到最高值，說明此時(shí)纖維素水解完全；當(dāng)緩沖溶液用量大于60mL后，纖維素測定量逐漸降低，這可能是由于緩沖溶液用量過大，導(dǎo)致了酶濃度降低，酶不能與底物充分接觸，從而使酶解效果變差。因此，選擇緩沖液用量為60mL。
2.1.2酶用量對(duì)纖維素水解的影響在緩沖液用量為60mL、其他條件不變的情況下，分別考察酶用量為0.05，0.10，0.15，0.20和0.25g時(shí)的酶解效果，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)酶用量為0.20g時(shí)，纖維素測定量最高，考慮到生物酶較容易部分失活，為保證纖維素水解完全，所以確定酶用量為0.25g。
2.1.3溫度對(duì)纖維素水解的影響在緩沖液用量為60mL和酶用量為0.25g的情況下，分別考察纖維素在30，35，40，45和50℃下的水解效果，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)溫度<35℃時(shí)，纖維素水解不完全，測定量較低；當(dāng)溫度>40℃時(shí)，纖維素測定量降低，這可能是因?yàn)闇囟冗^高導(dǎo)致酶失活，使纖維素水解不完全；較適宜的水解溫度為35~40℃，實(shí)驗(yàn)選擇37℃。
2.1.4時(shí)間對(duì)纖維素水解的影響在緩沖液用量為60mL、酶用量為0.25g和水解溫度為37℃的情況下，分別水解20，22，24，26和28h，結(jié)果（圖4）表明，24h后，纖維素水解完全，所以確定水解時(shí)間為24h。
2.2工作曲線與檢測限準(zhǔn)確稱取2.2009g葡萄糖，用蒸餾水溶解并定容至100mL，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。移取1，2，3，4，5mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別用蒸餾水稀釋并定容至100mL，搖勻，即得葡萄糖系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8和1.0mg/mL，相當(dāng)于纖維素0.18，0.36，0.54，0.72，0.90mg/mL。用流動(dòng)分析儀測定標(biāo)準(zhǔn)溶液中的葡萄糖含量，并對(duì)電信號(hào)響應(yīng)值Y（峰高，DU），與其濃度X（纖維素含量，mg/mL）進(jìn)行線性回歸分析，得其工作曲線回歸方程為：Y=15893.3X+2117.5，r=0.9998。可以看出，纖維素在0.18~0.90mg/mL濃度范圍內(nèi)，工作曲線線性良好，適合于定量分析。通過測定空白試樣，測得纖維素的檢測限［12］為0.11mg/mL。
2.3精密度和回收率采用本方法對(duì)煙草樣品的纖維素分別測定6次，測定量分別為125.8，120.7，126.9，127.3，126.2和125.1mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.40%，說明本方法的重復(fù)性較好。在脫糖煙草樣品中加入葡萄糖，測定其回收率，結(jié)果如表1所示。纖維素的回收率為96.7%~103.8%，說明本方法的準(zhǔn)確性較高。
2.4與經(jīng)典方法［3］比較分別用本方法和經(jīng)典方法測定16個(gè)煙草樣品的纖維素含量，結(jié)果如表2所示。通過對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣品t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)二者無顯著性差異，說明該方法適合于煙草中纖維素含量的檢測。
關(guān)鍵詞 米曲霉；固態(tài)發(fā)酵；纖維素酶活
中圖分類號(hào) S147.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）08-0197-02
Abstract The culture conditions affected the production of cellulose enzyme by Aspergillus oryzae，such as carbon source，nitrogen source，initial pH，water content，culture temperature，culture time，etc.The results showed that when the carbon source was bran，nitrogen source was powder of bean cake，initial pH value was 6.5，moisture content was 50%，culture temperature was 30 ℃，training time was 60 h，the cellulose enzyme activity produced by Aspergillus oryzae was the highest.
Key words Aspergillus oryzae；solid-state fermentation；cellulose enzyme activity
我國農(nóng)作物秸稈的利用率普遍很低，多數(shù)作物秸稈都作焚燒處理，對(duì)環(huán)境的污染很大。作物秸稈中含有豐富的有機(jī)質(zhì)、氮、磷、鉀等作物生長所需的營養(yǎng)元素，如果能得到合理的利用，將會(huì)為人類帶來巨大的收益。作物秸稈的處理方式有物理、化學(xué)、生物方法，其中生物降解具有污染少、能耗低等優(yōu)點(diǎn)[1]。作物秸稈中含有豐富的纖維素，纖維素在纖維素酶的作用下可以水解生成單糖被作物和微生物利用，但纖維素不易被降解，幾十年來，人們對(duì)于纖維素的預(yù)處理及酶水解過程進(jìn)行了大量研究，其中纖維素酶的使用大大提高了纖維素的降解率[2]。
米曲霉屬半知菌亞門絲孢綱絲孢目從梗孢科曲霉屬真菌中的一個(gè)常見種。米曲霉（Aspergillus oryzae）是纖維素酶的主要生產(chǎn)菌種之一。工業(yè)用米曲霉菌種所產(chǎn)的酶系較多、酶系組成較復(fù)雜[3]，國內(nèi)對(duì)該菌株的相關(guān)研究并不多，對(duì)其酶系在工業(yè)發(fā)酵過程中受到的影響因素及其作用機(jī)理并不十分了解，從而導(dǎo)致在工業(yè)生產(chǎn)過程中不能夠十分精確地控制米曲霉的產(chǎn)酶過程，限制了這一傳統(tǒng)的食用菌株在工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域的進(jìn)一步拓展[4]。本試驗(yàn)對(duì)米曲霉M1102產(chǎn)纖維素酶在固體發(fā)酵過程中所受的影響及活性變化進(jìn)行了研究，以期為米曲霉產(chǎn)纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供相關(guān)的理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 供試材料
1.1.1 菌種。米曲霉菌株M1102，來自中國菌種保藏中心。
1.1.2 培養(yǎng)基與主要試劑。斜面培養(yǎng)基：土豆培養(yǎng)基（PDA）；液體種子培養(yǎng)基：豆餅粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，蔗糖10 g/L，MgSO4 0.3 g/L，K2HPO4 0.3 g/L，調(diào)節(jié)pH值至7.0；營養(yǎng)鹽溶液：NaCl 2 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、CaCO3 0.5 g/L、MgSO4 0.5 g/L，調(diào)節(jié) pH值至7.0；固體培養(yǎng)基：木質(zhì)纖維素培養(yǎng)基；主要試劑：麩皮、稻殼粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖、豆餅粉、干酪素、蛋白胨、硫酸銨、尿素。
1.1.3 儀器設(shè)備。酒精燈、接種環(huán)、超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、pH測定儀、紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、控溫?fù)u床。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 培養(yǎng)方法。一是米曲霉種子液制備：將米曲霉接種于PDA斜面上進(jìn)行活化，用接種環(huán)挑取一環(huán)接種于250 mL三角瓶的種子液中，裝液量為50 mL，30 ℃，180 r/min，培養(yǎng)24 h。二是固體培養(yǎng)：在250 mL三角瓶中加入10 g風(fēng)干后過篩的木質(zhì)纖維原料和5 mL營養(yǎng)鹽溶液，拌勻，121 ℃滅菌30 min，冷卻后將種子液以3%的接種量接種于固體培養(yǎng)基中，32 ℃下培養(yǎng)60 h，測定其產(chǎn)纖維素酶活[5]。粗酶液的制備：每1g固態(tài)培養(yǎng)物加入磷酸緩沖溶液5.0 mL（pH值 7.2），室溫下浸提1 h，10 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。
1.2.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化。一是碳源對(duì)纖維素酶活的影響：分別用3%含量的麩皮、稻殼粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源，其他成分同初始培養(yǎng)基，培養(yǎng)結(jié)束后測定其纖維素酶含量[6]。二是氮源對(duì)纖維素酶活的影響：分別以2%的豆餅粉、干酪素、蛋白胨、硫酸銨、尿素作為培養(yǎng)基的氮源，其他成分同初始培養(yǎng)基，培養(yǎng)結(jié)束后測定培養(yǎng)基中纖維素酶含量[6]。三是發(fā)酵條件優(yōu)化：采用優(yōu)化后的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，在固定其他發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，逐一對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)的初始pH值、培養(yǎng)基含水量、培養(yǎng)時(shí)間、發(fā)酵溫度等培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。
1.2.3 纖維素酶活的測定方法。采用GB-羧甲基纖維素法（CMC法）。
2 結(jié)果與分析
2.1 培養(yǎng)基碳源對(duì)纖維素酶活力的影響
酶誘導(dǎo)物和酶蛋白質(zhì)前體同時(shí)對(duì)纖維素酶的合成有調(diào)控作用，酶誘導(dǎo)物一般為可利用的碳源，纖維素作為酶誘導(dǎo)物對(duì)纖維素酶的產(chǎn)生有重要作用。從圖1可以看出，在培養(yǎng)基其他基礎(chǔ)營養(yǎng)成分不變的前提下，改變碳源含量后，米曲霉產(chǎn)纖維素酶活發(fā)生顯著變化，其中碳源為麩皮時(shí)纖維素酶活最高；稻殼粉和玉米芯粉次之，為最高酶活的72%和68%；玉米粉和蔗糖為最高酶活的60%和37%；碳源為葡萄糖時(shí)纖維素酶活最低，僅為最高酶活的30%。當(dāng)碳源中纖維素含量豐富時(shí)，米曲霉產(chǎn)纖維素酶活力高，這是由于纖維素作為酶誘導(dǎo)物能刺激纖維素酶的產(chǎn)生，將其分解為可利用的單糖，而葡萄糖和蔗糖作為碳源時(shí)，米曲霉能直接利用其作為碳源，所以抑制了纖維素酶的產(chǎn)生。
2.2 培養(yǎng)基氮源對(duì)纖維素酶活力影響
氮源是酶蛋白質(zhì)前體的主要來源，因此氮源的類型和性質(zhì)同樣會(huì)影響纖維素酶的合成和分泌。選擇不同氮源作為單一氮源進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，來考察其對(duì)米曲霉產(chǎn)酶的影響。
從圖2可以看出，在試驗(yàn)選用的5種有機(jī)和無機(jī)氮源中，以豆餅粉作為氮源時(shí)米曲霉所產(chǎn)纖維素酶活性最高；干酪素和蛋白胨次之，纖維素酶活是豆餅粉作為單一氮源時(shí)活性的96%和81%；當(dāng)分別以硫酸銨和尿素為單一氮源時(shí)，米曲霉所產(chǎn)纖維素酶活性僅為最高酶活性的70%和68%。由此表明，有機(jī)氮源對(duì)纖維素酶活的影響大于無機(jī)氮源，這可能與有機(jī)氮源中營養(yǎng)成分含量多元化有關(guān)。
2.3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)纖維素酶活力的影響
微生物在生長繁殖和代謝過程中，由于營養(yǎng)物質(zhì)被分解利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，而培養(yǎng)基初始pH值不僅影響微生物的生長繁殖，且對(duì)其產(chǎn)酶情況有顯著的影響。在優(yōu)化培養(yǎng)基碳氮源基礎(chǔ)上，調(diào)節(jié)初始pH值為4.0～9.0來考察米曲霉產(chǎn)酶活性的變化。從圖3 可以看出，米曲霉產(chǎn)生纖維素酶的最佳初始pH 值為6.0～7.5，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為5.5，米曲霉仍能產(chǎn)生相對(duì)于最高活性 72%的纖維素酶；而當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值調(diào)至8.0 時(shí)，米曲霉產(chǎn)生纖維素酶活性則迅速下降至最高酶活性的34%。試驗(yàn)表明米曲霉產(chǎn)纖維素酶的pH值適應(yīng)范圍較寬，但過酸或過堿的環(huán)境不利于纖維素酶的生產(chǎn)。這可能是由于過酸或過堿的環(huán)境不利于米曲霉生長或破壞了纖維素酶活力。
2.4 培養(yǎng)基含水量對(duì)纖維素酶活力的影響
水分是微生物生長代謝的重要物質(zhì)，在固體發(fā)酵中，水分對(duì)微生物活性有重要影響。從圖4可以看出，隨著培養(yǎng)基中含水量的增加，米曲霉產(chǎn)纖維素酶活呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，當(dāng)培養(yǎng)基含水量為50%時(shí)，纖維素酶活最高。所以含水量過高或過低都會(huì)抑制米曲霉生長，這可能是由于低水分使米曲霉培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)溶解性降低，抑制了米曲霉生長；當(dāng)水分含量過高時(shí)，培養(yǎng)基過于黏稠，破壞了培養(yǎng)基的多孔結(jié)構(gòu)，降低了其透氣性，而米曲霉是耗氧微生物，低氧環(huán)境不利于其生長。
2.5 培養(yǎng)溫度對(duì)纖維素酶活力的影響
微生物最適宜的溫度范圍一般為16～30 ℃，最高溫度在37～43 ℃，溫度過高或過低均不利于米曲霉生長。從圖5可以看出，在30～35 ℃時(shí)，纖維素酶活最高，溫度過低或過高都會(huì)降低纖維素酶活。這是由于，當(dāng)溫度過低時(shí)，米曲霉生
長緩慢導(dǎo)致產(chǎn)生纖維素酶少，而且低溫環(huán)境會(huì)降低酶活力；當(dāng)溫度過高時(shí)，米曲霉會(huì)由于高溫而出現(xiàn)老化現(xiàn)象，抑制了纖維素酶產(chǎn)生，并且高溫容易使纖維素酶失活。
2.6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)纖維素酶活力的影響
微生物處于不同的生長期時(shí)，其相應(yīng)的生長代謝機(jī)理也不同。從圖6可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，米曲霉產(chǎn)纖維素酶活呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)培養(yǎng)至60 h時(shí)，纖維素
酶活最高。這是由于培養(yǎng)初期米曲霉處于繁殖階段，產(chǎn)生孢子數(shù)量有限，故分泌的纖維素酶少；而在培養(yǎng)后期，由于米曲霉出現(xiàn)老化，導(dǎo)致纖維素酶分泌量減少。
3 結(jié)論
本試驗(yàn)研究了米曲霉菌株M1102在不同固體發(fā)酵條件下產(chǎn)纖維素酶的變化。結(jié)果表明：當(dāng)碳源為麩皮，氮源為豆餅粉，初始pH值為6.5，含水量為50%，培養(yǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為60 h時(shí)，米曲霉產(chǎn)纖維素酶活力最高。為了深入了解米曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響因素，還需要對(duì)纖維素酶的生產(chǎn)條件和作用機(jī)理做更深一步的研究。
4 參考文獻(xiàn)
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1.1葡萄糖內(nèi)切酶
該酶作用于纖維素分子內(nèi)的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1，4-糖甘鍵，截短長鏈纖維素分子，產(chǎn)生許多帶有非還原性末端的小分子纖維素，但不能單獨(dú)作用于結(jié)晶的纖維素。同時(shí)它也能水解小分子的纖維寡糖。
1.2葡萄糖外切酶
這類酶作用于纖維素分子的末端，依次切下纖維素分子中的纖維二糖，可作用于纖維素分子內(nèi)的結(jié)晶區(qū)、無定形區(qū)和羧甲基纖維素。
1.3β-葡萄糖苷酶
也稱纖維二糖酶，是一種可將纖維二糖、纖維三糖和纖維六糖等水解為葡萄糖的非專一性酶；在水解過程中低聚糖對(duì)外切酶和內(nèi)切酶的產(chǎn)物產(chǎn)生抑制作用，這種酶的存在可以顯著降低抑制作用，提高水解效率。
2食品工業(yè)纖維素酶的來源
纖維素酶的來源非常廣泛，昆蟲、動(dòng)物體、微生物（細(xì)菌、放線菌、真菌、酵母）等都能產(chǎn)生纖維素酶。由于動(dòng)物體和放線菌的纖維素酶產(chǎn)量極低，所以很少研究。細(xì)菌所產(chǎn)生的酶是胞內(nèi)酶，或者吸附在菌壁上，很少能分泌到細(xì)胞外，提取純化的難度大。而且產(chǎn)量也不高，主要是中性和堿性的葡萄糖內(nèi)切酶。因其多數(shù)對(duì)結(jié)晶纖維素沒有活性，所以主要用于棉織品水洗整理工藝及洗滌劑工業(yè)中，在食品工業(yè)中應(yīng)用也較少[4]。目前，報(bào)道較多的是真菌，其產(chǎn)生的纖維素酶通常是胞外酶，酶一般被分泌到培養(yǎng)基中，用過濾和離心等方法就可較容易地得到無細(xì)胞酶制品。絲狀真菌產(chǎn)生的纖維素酶一般在酸性或中性偏酸性條件下水解纖維素底物，其中木霉纖維素酶產(chǎn)量高、酶系全，故而被廣泛應(yīng)用，尤其是里氏木霉、綠色木霉的研究較多。
2.1產(chǎn)纖維素酶里氏木霉的研究進(jìn)展
由于里氏木霉產(chǎn)纖維素酶量高、穩(wěn)定性好、適應(yīng)性強(qiáng)，便于生產(chǎn)和管理，因此具有突出的研究和利用價(jià)值。目前，在菌株選育上普遍采用人工誘變和基因工程改造兩種方案獲得高效分解纖維素的菌株。誘變的方法一般是傳統(tǒng)的物理誘變(紫外線)和化學(xué)誘變(亞硝基胍)。IKEM等以里氏木霉ATCC66589為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線誘變，獲得兩株突變菌株M2-1和M3-1。其濾紙酶活分別達(dá)到257U和281U。張素敏等利用紫外線誘變里氏木霉T306，得到突變菌株的CMCA活力達(dá)到64.2U/mL[5]。在化學(xué)誘變劑中，烷化劑可與巰基、氨基和羧基等直接反應(yīng)，故更易誘發(fā)基因突變。DURANDH等用亞硝基胍誘變里氏木霉QM9414，得到一株穩(wěn)定性較好的突變菌株CL847，F(xiàn)PA酶活最高達(dá)到5.2U/mL，較出發(fā)菌株提高了4倍[6]。也有紫外線與亞硝酸鈉、亞硝基胍等化學(xué)試劑復(fù)合誘變的研究，取得了較好的效果。這些研究對(duì)里氏木霉高產(chǎn)纖維素酶菌株的選育及其工業(yè)化應(yīng)用具有顯著意義。基因工程改造可以從不同產(chǎn)纖維素酶菌株中篩選出比活力高、酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的基因重組在一起并高效表達(dá)，具有定向性，是選育出高產(chǎn)纖維素酶菌株的有效途徑。目前已成功在里氏木霉中克隆表達(dá)的基因有纖維二糖酶基因、celEn、pBGL1、af211、Neg[7]。
2.2產(chǎn)纖維素酶綠色木霉的研究進(jìn)展
綠色木霉酶活較大，是目前公認(rèn)較好的纖維素酶生產(chǎn)菌。目前的研究主要集中于綠色木霉產(chǎn)纖維素酶生產(chǎn)工藝的研究。陳莉等采用固態(tài)發(fā)酵方法研究了不同條件對(duì)其產(chǎn)纖維素酶活的影響。得出綠色木霉固態(tài)產(chǎn)酶發(fā)酵的最優(yōu)條件是培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間5d，接種量5%，含水量250%。在實(shí)際發(fā)酵過程中，不同的酶組分達(dá)到最大酶活的時(shí)間也有不同，例如FPA酶活在發(fā)酵2d后達(dá)到最高值,Cx酶活在發(fā)酵3d后達(dá)到最高值。以蛋白胨為唯一氮源時(shí)，纖維素酶活力最高，以尿素為唯一氮源時(shí)，纖維素酶活力最低。綠色木霉分泌的酶系偏酸性,發(fā)酵液初始pH值為4.5時(shí)，F(xiàn)PA酶活和Cx酶活都出現(xiàn)最高值。因此在實(shí)際應(yīng)用中也可以根據(jù)需要來調(diào)整不同酶組分的含量，以及合適的氮源，適宜的pH值等[8-9]。黃發(fā)等人對(duì)綠色木霉產(chǎn)β-葡聚糖酶的工藝條件研究也得出了類似的結(jié)果[10]。
3纖維素酶在食品工業(yè)的應(yīng)用
3.1在果蔬加工中的應(yīng)用
在果蔬的加工過程中,為了使得植物組織快速軟化和膨潤,常常采用加熱蒸煮或酸堿處理等方法。這樣一來就使得蔬菜、果實(shí)的香味和維生素等損失很大。通過使用纖維素酶來進(jìn)行蔬菜的軟化可以避免這一缺點(diǎn)。除此以外,通過采用纖維素酶對(duì)蔬菜和果實(shí)進(jìn)行分解,可以使加工的果醬口感增加;還可以用纖維素酶來分解蘑菇,制造一種很好的調(diào)味料;在糖果品加工工藝中也可以采用纖維素酶來縮短砂糖進(jìn)入果實(shí)當(dāng)中的時(shí)間，以更快地達(dá)到浸透效果[11]。朱莉莉等研究了羊棲菜汁浸提工藝條件,通過研究最適范圍各個(gè)單因素發(fā)現(xiàn)，在復(fù)合酶酶解提取羊棲菜汁的最佳浸提方案中,添加纖維素酶與果膠酶配比3:2可以大大提高浸提率[12]。
3.2在大豆加工中的應(yīng)用
纖維素酶用于對(duì)大豆的處理,可以促使其大豆快速脫皮,與此同時(shí),由于纖維素酶可以破壞其細(xì)胞壁,從而使得包含在細(xì)胞中的油脂和蛋白質(zhì)完全的分離開來,導(dǎo)致大豆和豆餅中提取優(yōu)質(zhì)的水溶性蛋白質(zhì)和油脂的得率明顯增加，不但降低了生產(chǎn)成本，而且還顯著地縮短了生產(chǎn)時(shí)間,更是提高了生產(chǎn)產(chǎn)品的品質(zhì)。
3.3在茶葉加工中的應(yīng)用
隨著茶飲料工業(yè)的快速發(fā)展，茶水飲料生產(chǎn)的方式漸漸地由最初飲料廠的全程生產(chǎn)方式向由原料廠商只是生產(chǎn)茶濃縮汁這一方式過度,這就使得我國的茶葉濃縮汁、速溶茶等生產(chǎn)發(fā)展快速。隨著近現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展,外源的生物酶在茶葉提取、加工中得到充分的應(yīng)用。酶法提取的原理為利用其纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等水解酶分解茶葉的細(xì)胞壁,使得細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)致茶葉中的有效成分快速擴(kuò)散與浸出,有利于提高固形物的溶出和浸提率。在茶葉提取生產(chǎn)的過程中，纖維素酶可以提升其可溶性糖類的含量以及水浸出物得率，并且還可以促進(jìn)氨基酸、茶多酚、咖啡堿等物質(zhì)的溶出，有利于釋放出芳香性物質(zhì)，有顯著的增香效果[13]。
4纖維素酶在釀造、發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用
4.1在醬油、食醋釀造中的應(yīng)用
醬油釀造主要是利用蛋白酶及淀粉酶等酶類對(duì)原料進(jìn)行相應(yīng)的酶解，而在該過程中如果添加使用纖維素酶，就可以使大豆等原料的細(xì)胞膜軟化、膨脹等細(xì)胞破壞作用更加明顯，使得包藏在細(xì)胞中的碳水化合物、蛋白質(zhì)等順利釋放，從而縮短釀造時(shí)間，并且可以顯著提高產(chǎn)率及品質(zhì)，使醬油中的還原糖和色度明顯增加，風(fēng)味得到明顯改善[14]。在食醋釀造過程中，通過纖維素酶與糖化酶混合使用，可以顯著提升原料利用率及出品率。郝建新等以綠原酸為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行了添加纖維素酶發(fā)酵醋的工藝研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用纖維素酶等酶后，得到的發(fā)酵醋色澤澄清，并具備醋特有的香氣，口感也很柔和，而且具有比較好的體外抗氧化的效果[15]。
4.2在啤酒加工過程中的應(yīng)用
把纖維素酶利用在啤酒工業(yè)的麥芽生產(chǎn)當(dāng)中，可以增加麥粒等的溶解性，減少糖化液中R-葡萄糖的含量，明顯提高過濾性能。張麟等對(duì)啤酒糟進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理過程中添加纖維素酶水解比只用機(jī)械處理得到的可溶性糖含量有明顯提高[16]。
4.3在飲料中的應(yīng)用
馮丹等用新鮮的豆渣為原材料，利用纖維素酶對(duì)原料進(jìn)行酶解，可以獲得其水溶性膳食纖維等提取液，添加輔料可混合調(diào)配成一類酸甜適口，體系均一，滋味純正，并且具有一定保健功能的膳食纖維類飲料。且研究發(fā)現(xiàn)其具有較好的穩(wěn)定性[17]。
4.4在酒精發(fā)酵中的應(yīng)用
通過在原料中添加纖維素酶來釀酒，可以增加出酒量，節(jié)約糧食20%左右，而且釀出的酒酒味醇香，雜醇油含量低。尤其是白酒當(dāng)中，添加纖維素酶以后，可以同時(shí)將淀粉和纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性的糖，再經(jīng)過酵母分解而全部轉(zhuǎn)化為酒精，提高出酒率且酒的品質(zhì)純正。在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用纖維素酶，不僅可以提高發(fā)酵產(chǎn)率，而且能夠顯著縮短發(fā)酵時(shí)間[1]。此外，利用纖維素酶水解木質(zhì)素生產(chǎn)乙醇用于化工、能源等方面對(duì)于目前的全球資源短缺現(xiàn)狀的緩解也具有重要意義。
5纖維素酶在纖維廢渣回收利用方面的應(yīng)用
利用其纖維素酶或微生物,把農(nóng)副產(chǎn)品、城市廢料中的纖維素進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成為酒精、葡萄糖和單細(xì)胞蛋白質(zhì)等產(chǎn)品,這對(duì)于開辟食品工業(yè)的原材料來源、提供新型能源和變廢為寶等方面具有十分重要的價(jià)值和意義。例如纖維素酶應(yīng)用于動(dòng)物飼料的添加劑、紡織、造紙、醫(yī)藥保健、石油開采、新型能源、環(huán)保等領(lǐng)域都具有很大的潛力。
6展望
關(guān)鍵詞：纖維素分解菌；發(fā)酵條件；纖維素酶；酶活力
中圖分類號(hào)：TQ920．1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439－8114（2012）06－1232-02
Research on the Optimum Fermentation Conditions of High-Yield Cellulolytic
Enzymes Strain ZJW-6
TANG Rui
（Department of Biology and Chemistry， Xingtai University， Xingtai 054001， Hebei， China）
Abstract： The optimum fermentation conditions of high－yield cellulolytic enzymes strain ZJW－6 were studied in this paper． The strain was cultured under different liquid fermentation conditions and enzymes activity of bacteria suspension was determined using DNS method． The results showed that the optimum fermentation conditions of ZJW－6 was as follows： peptone and （NH4）2SO4 as nitrogen source， shaking for 48h at 30℃ and pH 6．
Key words： cellulose－decomposing microorganisms； fermentation conditions； cellulose； enzyme activity
纖維素酶是指能降解纖維素生成纖維素二糖和葡萄糖等小分子物質(zhì)的一組酶的總稱。隨著人們對(duì)纖維素酶研究的深入，纖維素酶在食品、飼料、環(huán)境保護(hù)、能源和資源開發(fā)等各個(gè)領(lǐng)域中發(fā)揮著越來越大的作用，因而引起了全世界的關(guān)注，其研究也取得了很大進(jìn)展。但是纖維素酶的生產(chǎn)仍然存在著酶活力低、生產(chǎn)周期長等問題，大大限制了其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)［1］。對(duì)高產(chǎn)纖維素酶菌株ZJW－6采用單因素試驗(yàn)法進(jìn)行不同條件下的液體發(fā)酵培養(yǎng)，使用DNS法對(duì)發(fā)酵后的菌懸液進(jìn)行酶活力測定從而獲得最優(yōu)發(fā)酵條件，旨在為其工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1．1 材料
1．1．1 菌種 菌種為邢臺(tái)學(xué)院生物化學(xué)系微生物實(shí)驗(yàn)室篩選并保存的產(chǎn)纖維素酶菌株。
1．1．2 培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10.0 g／L，蛋白胨10.0 g／L，磷酸二氫鉀1.0 g／L，硫酸銨0．2 g／L，氯化鈉10.0 g／L，去離子水1 000 mL，pH 7.0［2］。
1．2 方法
1．2．1 待測酶液的制備 將各種不同培養(yǎng)條件下的單因素限制性的液體發(fā)酵菌懸液倒入離心管中，3 000 r／min離心15 min，取上清液作為待測粗酶液。
1．2．2 纖維素酶活力的測定 參照文獻(xiàn)［3］和文獻(xiàn)［4］使用DNS法測定酶活力。將在40 ℃、pH 4．6條件下，1 min分解羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg同葡萄糖的還原糖量所需的酶量，規(guī)定為一個(gè)酶活力單位。
1．2．3 發(fā)酵條件優(yōu)化研究［5，6］ 分別取ZJW－6的菌懸液1 mL加入到含有等量培養(yǎng)基的試管中，在不同時(shí)間、不同培養(yǎng)方式、不同培養(yǎng)溫度、不同初始pH的條件下培養(yǎng)，測其酶活力。
2 結(jié)果與分析
2．1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)纖維素酶活力的影響
菌株ZJW－6不同培養(yǎng)時(shí)間所產(chǎn)纖維素酶的活力見圖1。從圖1可以看出，在培養(yǎng)48 h以前酶活力顯著提高，48~72 h酶活力顯著下降，在培養(yǎng)72 h以后酶活力雖有上升，但增幅較小，可見培養(yǎng)48 h為其最適發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間。
2．2 不同培養(yǎng)方式對(duì)纖維素酶活力的影響
菌株ZJW－6不同培養(yǎng)方式所產(chǎn)纖維素酶的活力測定結(jié)果見表1。從表1可以看出，靜置培養(yǎng)4 d酶活力為118 U／mL，振蕩培養(yǎng)4 d酶活力達(dá)138 U／mL，明顯高于靜置培養(yǎng)。可見振蕩條件下培養(yǎng)對(duì)菌株ZJW－6產(chǎn)纖維素酶有利。
2．3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)纖維素酶活力的影響
菌株ZJW－6不同培養(yǎng)溫度所產(chǎn)纖維素酶的活力測定結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，在26~28 ℃條件下培養(yǎng)，酶活力有所提高，當(dāng)達(dá)到30 ℃時(shí)酶活力明顯提高，到了32 ℃時(shí)酶活力又顯著降低，可見菌株ZJW－6產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)溫度為30 ℃。
2．4 不同培養(yǎng)基初始pH對(duì)纖維素酶活力的影響
菌株ZJW－6在不同培養(yǎng)基初始pH條件下所產(chǎn)纖維素酶的活力測定結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，在培養(yǎng)基初始pH由5變?yōu)?時(shí)酶活力顯著提高，在培養(yǎng)基初始pH大于6以后酶活力又逐漸下降，表明培養(yǎng)基初始pH 6是其最適產(chǎn)酶pH。
3 小結(jié)與討論
綜合試驗(yàn)中最適培養(yǎng)基和最優(yōu)發(fā)酵條件的結(jié)果，得出菌株ZJW－6產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)發(fā)酵條件為在蛋白胨+（NH4）2SO4的氮源培養(yǎng)基上，30 ℃、培養(yǎng)基初始pH 6、振蕩培養(yǎng)48 h。
試驗(yàn)充分說明了產(chǎn)纖維素酶菌株在不同的培養(yǎng)條件下產(chǎn)纖維素酶的能力明顯不同，對(duì)其最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行研究很有必要。國內(nèi)外對(duì)于產(chǎn)纖維素酶菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的研究比較少，遲乃玉等［7］對(duì)纖維素酶高產(chǎn)菌株97－B最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，陳亮等［8］對(duì)低溫纖維素酶菌株CNY086進(jìn)行了選育及發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究，徐長安等［4］篩選得到一株海洋芽孢桿菌B09并對(duì)其進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化研究。因?yàn)楫a(chǎn)纖維素酶菌株的產(chǎn)酶能力受多種因素的影響，因此不同的菌株，不同的培養(yǎng)條件，不同的培養(yǎng)基配方都還有很大的研究空間，需要進(jìn)一步研究。
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[關(guān)鍵詞] 青蒿素；纖維素酶；提取
[中圖分類號(hào)] R965.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2013）08（c）-0014-03
青蒿素（artemisinin，C15H22O5）是治療瘧疾的特效藥，具有速效、高效和低毒等抗瘧性能[1]。目前，青蒿素主要從黃花蒿（Artemisia annua L.）中提取[2]。近年來，用于天然產(chǎn)物提取的新技術(shù)如微波技術(shù)、酶技術(shù)等迅速涌現(xiàn)，并取得顯著的成效[3]。酶技術(shù)具有反應(yīng)效率高、條件溫和、專一性強(qiáng)和有效成分破壞少等優(yōu)點(diǎn)[4]，受到廣泛關(guān)注。
我國是黃花蒿的主產(chǎn)國，將酶技術(shù)應(yīng)用于青蒿素的提取過程，對(duì)提高提取效率、充分利用資源有重要意義。本研究對(duì)纖維素酶輔助提取青蒿素的條件進(jìn)行研究，分析各因素對(duì)提取率的影響，并采用正交實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)酶輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為纖維素酶在青蒿素提取工藝中的應(yīng)用提供參考。
1材料與方法
1.1 材料
青蒿藥材購于廣州市清平中藥材市場（生產(chǎn)批號(hào)120711），經(jīng)鑒定為菊科植物黃花蒿的干燥地上部分，藥材經(jīng)粉碎后過40目篩備用。纖維素酶Cellulase T4（來源于綠色木霉Trichoderma viride，生產(chǎn)批號(hào)20120922）購自天野酶制劑（上海）有限公司。青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品（生產(chǎn)批號(hào)A2118）購自百靈威科技有限公司，無水乙醇、95%乙醇、氫氧化鈉、乙酸、乙酸鈉等試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。
1.2 儀器設(shè)備
FW135型中藥粉碎機(jī)，SHA-2型恒溫水浴振蕩器，HH-4型恒溫水浴鍋，752型紫外可見分光光度計(jì)，SHZ-D型循環(huán)水真空泵。
1.3 方法
1.3.1纖維素酶輔助提取青蒿素的方法
稱取1 g粉碎后的青蒿樣品置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，先常溫下浸泡10 min，再加入一定量的纖維素酶，然后在一定溫度下水浴振蕩進(jìn)行酶反應(yīng)。酶反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，將濾餅置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml 無水乙醇，在45℃下水浴振蕩1 h，抽濾，取濾液測定青蒿素含量。
1.3.2青蒿素含量的測定方法
青蒿素僅在紫外區(qū)203 nm處有較弱的末端吸收，但與堿反應(yīng)后，生成一化合物Q292，該物質(zhì)在292 nm處有最大吸收，可用紫外分光光度法檢測[5]。取樣品溶液0.5 ml加入95%乙醇4.5 ml，再加入0.2% NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加熱30 min，取出快速冷卻，在292 nm處測定吸光值，每組測定3個(gè)平行樣品，取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出青蒿素含量。
2結(jié)果
2.1青蒿素含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線
精確稱取青蒿素標(biāo)準(zhǔn)樣品10 mg，溶于95%的乙醇溶液，定容至100 ml容量瓶中，配制成0.1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5 ml，加95%的乙醇溶液至5 ml，再加入0.2%NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加熱30 min，取出快速冷卻，在292 nm處測定吸光值，每組取3個(gè)平行樣品，取平均值。以青蒿素樣品濃度x（g/L）為橫坐標(biāo)，292 nm吸光值y為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果見圖1。在292 nm下，青蒿素濃度在0～1 g/L的范圍內(nèi)，與吸光值呈良好的線性關(guān)系，表明測定方法準(zhǔn)確可靠。
2.2 不同酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)青蒿素提取的影響
按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纖維素酶，在45℃下水浴振蕩反應(yīng)，酶反應(yīng)緩沖液pH值為4.5，反應(yīng)時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h，測定酶輔助提取后樣品青蒿素含量。以不加入纖維素酶進(jìn)行提取的樣品中青蒿素含量為100%進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果見圖2。隨著時(shí)間的延長，青蒿素的提取率逐漸增加，在3 h左右達(dá)到最大值，再延長提取酶反應(yīng)的時(shí)間，青蒿素的提取率基本不變。
2.3 不同加酶量對(duì)青蒿素提取的影響
按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中分別加入0.1、0.2、0.3、0.4g纖維素酶，在45℃下水浴振蕩反應(yīng)，酶反應(yīng)緩沖液pH值為4.5，反應(yīng)時(shí)間1 h，測定酶輔助提取后樣品青蒿素含量。以不加入纖維素酶進(jìn)行提取的樣品中青蒿素含量為100%進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果見圖3。隨著酶添加量的增加，青蒿素的提取率逐漸增加，當(dāng)加入0.3 g的纖維素酶時(shí)，達(dá)到最大值，再增加酶用量，青蒿素的提取率基本不變。
2.4 不同酶反應(yīng)溫度對(duì)青蒿素提取的影響
按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纖維素酶，分別在40、45、50、55℃下水浴振蕩反應(yīng)，酶反應(yīng)緩沖液pH值為4.5，反應(yīng)時(shí)間為1 h，測定酶輔助提取后樣品青蒿素含量。以不加入纖維素酶進(jìn)行提取的樣品中青蒿素含量為100%進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果見圖4。隨著溫度的增加，青蒿素的提取率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，在酶反應(yīng)溫度為45℃時(shí)達(dá)到最大值。
2.5不同酶反應(yīng)pH值對(duì)青蒿素提取的影響
按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纖維素酶，在45℃下水浴振蕩反應(yīng)，酶反應(yīng)緩沖液pH值分別為4.0、4.5、5.0和5.5，反應(yīng)時(shí)間為1 h，測定酶輔助提取后樣品青蒿素含量。以不加入纖維素酶進(jìn)行提取的樣品中青蒿素含量為100%進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果如圖5。酶反應(yīng)的pH值對(duì)青蒿素的提取率基本無影響，在pH值為4.5時(shí)，青蒿素提取率達(dá)到最大值。
2.6 纖維素酶輔助提取青蒿素工藝條件的優(yōu)化
在纖維素酶輔助提取青蒿素的過程中，酶反應(yīng)時(shí)間、酶的添加量和酶反應(yīng)溫度對(duì)青蒿素的提取影響較大，而酶反應(yīng)過程中緩沖液的pH值對(duì)青蒿素的提取基本無影響。因此，選取酶反應(yīng)時(shí)間、酶添加量和反應(yīng)溫度作為主要影響條件，利用試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design expert 7.5作三因素兩水平正交實(shí)驗(yàn)L4（23），正交實(shí)驗(yàn)水平見表1。
按照軟件設(shè)計(jì)的正交實(shí)驗(yàn)表中各因素水平，開展實(shí)驗(yàn)，然后對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。正交實(shí)驗(yàn)表和結(jié)果分析見表2。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析表明：酶輔助提取反應(yīng)各條件對(duì)提取率的影響試驗(yàn)中，酶反應(yīng)時(shí)間（A）的最優(yōu)值為水平1，酶添加量（B）的最優(yōu)值為水平2，溫度（C）的最優(yōu)值為水平2，實(shí)驗(yàn)中各因素對(duì)輔助提取反應(yīng)的影響順序?yàn)椋好阜磻?yīng)時(shí)間>酶添加量>溫度。
利用Design expert7.5對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，方差分析結(jié)果見表3。方差分析結(jié)果表明：在P
3討論
黃花蒿為菊科艾屬一年生草本植物，在我國各地均有分布[6]。青蒿素是從黃花蒿干燥地上部分分離提取得到的一種新型化合物，其具有含過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，與已知抗瘧藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)完全不同[7]，被世界衛(wèi)生組織稱為“唯一有效的瘧疾治療藥物”。由于青蒿素的化學(xué)合成尚未顯示出商業(yè)可行性，目前商用的青蒿素主要通過植物提取[8]。工業(yè)化提取青蒿素中應(yīng)用范圍最廣的是有機(jī)溶劑提取法，但存在提取效率低、提取率不高、溶劑消耗大和安全隱患等問題[3]。
天然產(chǎn)物的有效成分主要存在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞壁的阻礙影響了提取率。纖維素酶是最常見的破壁酶，它可作用于天然產(chǎn)物纖維素為主的細(xì)胞壁，破壞細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞內(nèi)活性成分的溶出量，提高提取率[9]。纖維素酶Cellulase T4來源于綠色木霉，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，纖維素酶能夠有效降解青蒿植物的細(xì)胞壁，增加青蒿素的提取率。不同的纖維素酶有不同的最佳反應(yīng)條件，常見的影響因素有溫度、pH、酶的用量、激活劑和抑制劑等[10]。本文單因素及正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Cellulase T4水解青蒿植物細(xì)胞壁的最佳條件為酶反應(yīng)時(shí)間為2 h，酶添加量為0.30 g，反應(yīng)溫度為45 ℃，酶反應(yīng)pH值4.5。在最優(yōu)條件下，纖維素酶輔助提取青蒿素較未使用酶輔助的提取方法，提取率提高了1.96倍。本實(shí)驗(yàn)為纖維素酶在青蒿素提取方面的應(yīng)用提供了理論指導(dǎo)，為酶技術(shù)在中藥制藥方面的研究和應(yīng)用開拓了更為廣闊的空間。
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關(guān)鍵詞 稻草秸稈；固態(tài)發(fā)酵；纖維素酶
中圖分類號(hào) TQ929 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2011）12-0049-03
纖維素是可再生能源物質(zhì)，總產(chǎn)量占地球植物干重的1/3～1/2，植物纖維素因其含量豐富及巨大的潛在利用價(jià)值而被認(rèn)為是一種極有開發(fā)前景的原料。因此，纖維素的分解利用對(duì)于解決未來的能源危機(jī)與環(huán)境問題具有十分重大的意義。利用纖維素酶將植物纖維原料水解是合理利用可再生資源的一條有效途徑，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)是纖維素酶的生產(chǎn)。纖維素酶在食品、飼料、農(nóng)副產(chǎn)品加工、印染紡織、制漿造紙、石油開采和資源再生等方面具有廣泛的用途和應(yīng)用前景[1]。
高成本、低收益是限制纖維素酶在工業(yè)應(yīng)用中的主要問題，研究人員在利用廉價(jià)的基質(zhì)進(jìn)行纖維素酶生產(chǎn)方面做了大量的研究工作，在把注意力放在選育高效降解纖維素的微生物的同時(shí)，也十分關(guān)注如何改善發(fā)酵的過程。固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵相比，具有設(shè)備投資少、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)。因此，固態(tài)發(fā)酵技術(shù)在纖維素酶生產(chǎn)方面已引起了廣泛的重視[2]。該文對(duì)綠色木霉-M1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)綠色木霉-M1的產(chǎn)酶曲線進(jìn)行了科學(xué)研究，以期為進(jìn)一步利用廉價(jià)基質(zhì)生產(chǎn)纖維素酶奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
1.1.1 原料。氨化預(yù)處理稻草粉，麩皮（市售）。
1.1.2 菌種。綠色木霉-M1菌株（實(shí)驗(yàn)室保存）。
1.1.3 培養(yǎng)基。具體種類如下：①斜面培養(yǎng)基。即PDA培養(yǎng)基。液態(tài)種子培養(yǎng)基：馬鈴薯汁，2%葡萄糖，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。②固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基。稻草粉7 g，麩皮3 g，（NH4）2SO4 0.2 g，水20 mL，pH值自然，121 ℃滅菌50 min。
1.1.4 試劑。鹽酸、硫酸、氨水、氫氧化鈉、3，5－二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、硫酸銨、尿素、蛋白胨、硝酸鈉、硝酸銨、氯化銨、無水葡萄糖等試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.1.5 儀器與設(shè)備。電熱鼓風(fēng)干燥箱、電子天平、離心機(jī)、分光光度計(jì)、高壓蒸汽滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器、水浴鍋、超凈工作臺(tái)等。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱取100.0 mg分析純無水葡萄糖（預(yù)先在105 ℃烘干至恒重），用少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，再定容至刻度，搖勻，濃度為1 mg/mL。取8支試管，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入2.5 mL DNS試劑混合均勻，在沸水浴中加熱5 min，取出后立即用流水冷卻到室溫，定容至25 mL，搖勻。于520 nm波長處測定OD值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.832 x+0.000 3，R2=0.999 5。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。
1.2.2 DNS試劑配制。稱取200 g酒石酸鉀鈉，溶于一定量水中，加熱溶解，添加10.0 g 3，5-二硝基水楊酸、10.0 g氫氧化鈉，溶解后加入2 g苯酚、0.5 g無水亞硫酸鈉，全部加熱溶解后，冷卻至室溫，定容至1 000 mL。用前一周配制。
1.2.3 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)方法。將綠色木霉-M1接種于PDA斜面活化，用接種環(huán)挑取一環(huán)接種于裝有30 mL液態(tài)種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃ 150 r/min搖床培養(yǎng)72 h；然后接種于裝有固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，混勻后于試驗(yàn)要求的條件下靜置培養(yǎng)。
1.2.4 粗酶液的制備。稱取1 g發(fā)酵后的鮮曲，加10 mL蒸餾水，攪拌，于40 ℃水浴中保溫45 min，用脫脂棉過濾，3 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液。另取一定量發(fā)酵后的鮮曲，80 ℃烘干至恒重，測定水分含量。
1.2.5 FPA、CMC酶活力的測定[3-4]。酶活力單位規(guī)定：以每克干物質(zhì)1 min水解生成1 mg葡萄糖的酶量為1個(gè)國際單位（IU，簡寫為U）[5]。
1.2.6 單因素試驗(yàn)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和前期試驗(yàn)，影響綠色木霉-M1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的主要因素有稻草和麩皮比例、氮源濃度、料液比、培養(yǎng)溫度等，分別對(duì)這些影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。
1.2.7 正交試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)綠色木霉-M1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，具體設(shè)計(jì)見表1。
2 結(jié)果與分析
2.1 稻草粉和麩皮比例對(duì)酶活的影響
改變固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中稻草粉和麩皮的比例進(jìn)行試驗(yàn)，接種10%的液態(tài)種子，混勻后于28 ℃靜置培養(yǎng)4 d后測酶活，結(jié)果見圖2。
可以看出，當(dāng)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中麩皮含量增大時(shí)，固態(tài)發(fā)酵后所得粗酶液的FPA和CMC酶活逐漸增大，當(dāng)?shù)静莘酆望熎け壤秊?∶3時(shí)，F(xiàn)PA和CMC酶活均達(dá)到最大。隨著麩皮含量繼續(xù)增加，培養(yǎng)基蓬松程度降低，減少了通氣量，影響產(chǎn)酶，F(xiàn)PA和CMC酶活呈下降趨勢。
2.2 氮源濃度對(duì)酶活的影響
改變固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中氮源的濃度，接種10%的液態(tài)種子，混勻后于28 ℃靜置培養(yǎng)4 d后測酶活，結(jié)果如圖3。
可以看出，隨著氮源濃度的增大，發(fā)酵后所得粗酶液的酶活也逐漸增大，但當(dāng)加入氮源的濃度超過2.0%時(shí)，所得粗酶液的酶活緩慢下降。氮源濃度過低，不能滿足菌體生長，氮源濃度過大，對(duì)產(chǎn)酶有一定的抑制作用。
2.3 料液比對(duì)酶活的影響
改變固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的料液比，接種10%的液態(tài)種子，28 ℃靜置培養(yǎng)4 d后測酶活，結(jié)果見圖4。
可以看出，水分含量過低時(shí)，菌體生長得不到充足的水分，不利于菌體的生長，發(fā)酵后所得粗酶液的酶活較低；水分含量過高時(shí)，影響氧的傳送，會(huì)抑制菌體生長，因而粗酶液的酶活也較低。當(dāng)料液比為1∶2.5時(shí)，固態(tài)發(fā)酵所得粗酶液的酶活最大。
2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響
以固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基為產(chǎn)酶培養(yǎng)基，接種10%的液態(tài)種子，搖勻后分別置于24、26、28、30、32 ℃靜置培養(yǎng)4 d后測酶活，結(jié)果見圖5。
可以看出，溫度過低不利于菌體的生長，溫度過高也會(huì)限制菌體的生長。培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)，所得粗酶液的酶活最高。
2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果
根據(jù)正交試驗(yàn)表的設(shè)計(jì)方案，改變固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件，接種10%的液態(tài)種子，搖勻后靜置培養(yǎng)4 d測酶活，結(jié)果見表2。
由表2可知，綠色木霉-M1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)FPA酶的較優(yōu)條件為D2A2B3C3，即培養(yǎng)溫度28 ℃，稻草和麩皮比例為7∶3，氮源濃度為2.5%，料液比為1∶3；綠色木霉-M1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)CMC酶的較優(yōu)條件為D2C2B1A1，即培養(yǎng)溫度28℃，料液比為1∶2.5，氮源濃度1.5%，稻草和麩皮比例為8∶2。綜合考慮FPA和CMC酶活2個(gè)指標(biāo)，綠色木霉-M1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的較優(yōu)條件為D2C2B1A2，即培養(yǎng)溫度28℃，料液比為1∶2.5，氮源濃度1.5%，稻草和麩皮比例為7∶3。
2.6 培養(yǎng)時(shí)間與酶活的關(guān)系
根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)于固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)定如下條件培養(yǎng)：溫度28 ℃，料液比為1∶2.5，氮源濃度1.5%，稻草和麩皮比例為7∶3，液態(tài)種子接種量為10%的液態(tài)種子，pH值自然。從培養(yǎng)0 h開始，每隔12 h測定FPA和CMC酶活，培養(yǎng)時(shí)間與酶活的關(guān)系見圖6。
由于麩皮中含有多種維生素和微生物所必須的生長因子，在發(fā)酵開始的0～60 h，綠色木霉-M1利用麩皮產(chǎn)生纖維素酶，60 h后麩皮中的營養(yǎng)物質(zhì)幾乎被消耗殆盡，綠色木霉-M1開始利用稻草粉產(chǎn)生纖維素酶，由于從利用麩皮到利用稻草粉之間需要適應(yīng)的過程，因而在60～72 h內(nèi)纖維素酶的活力下降，綠色木霉-M1適應(yīng)在稻草粉上生長后，纖維素酶的活力又開始上升，在108 h時(shí)酶活力達(dá)到最大值。隨著生長時(shí)間的延長，一方面，酶解產(chǎn)物對(duì)纖維素酶產(chǎn)生了抑制作用；另一方面，由于菌體逐漸衰老，導(dǎo)致酶活力開始下降。
3 結(jié)論
對(duì)綠色木霉-M1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：綠色木霉-M1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的較優(yōu)條件為培養(yǎng)溫度28 ℃，料液比1∶2.5，氮源濃度1.5%，稻草和麩皮比例為7∶3。綠色木霉-M1在固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的0～60 h，利用麩皮產(chǎn)生纖維素酶，60 h后麩皮中的營養(yǎng)物質(zhì)被利用完，開始利用稻草粉產(chǎn)生纖維素酶，在60～72 h內(nèi)纖維素酶酶活下降，72 h后，纖維素酶酶活又開始上升，在108 h酶活力最高。纖維素是地球上數(shù)量最大的可再生資源，其生物轉(zhuǎn)化與利用對(duì)解決當(dāng)前世界面臨的能源危機(jī)、糧食短缺和環(huán)境污染等問題具有非常重要的意義，隨著研究工作的不斷深入開展，纖維素酶的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒃絹碓綇V。
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【關(guān)鍵詞】 黃柏 小檗堿 纖維素酶 超聲波
Extraction Study of Berberine from Cortex Phellodendri by Ultrasonic Wave- Cellulase
XU Yan，LIU Shaoxia，SUN Juan
School of Bioscience and Technology，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161， China
Abstract：ObjectiveTo study the application effect on extraction of berberine from Cortex phellodendri by ultrasonic wave- cellulase.MethodsBased on the single factors test and orthogonal test the effect of different factors on extraction of berberine from Cortex phellodendri by ultrasonic wave-cellulase was studied，and extracting conditions was optimized.ResultsThe best extraction condition was that time was 2.5 h， the power of ultrasonic wave was 80 ℃ ， the volume of cellulase was 25 ml， temperature was 60 ℃.ConclusionThe berberine of Cortex Phellodendri is extracted by Ultrasonic wave-Cellulase ，which can save time and enhance extract-efficiency， save organic solvent and reduce the use of energy .
Key words：Cortex Phellodendri; Berberine; Cellulase; Ultrasonic wave
黃柏是蕓香科植物黃皮樹或黃檗的干燥樹皮，黃柏具有抗病原微生物、抗?jié)儭⒔祲骸⒖剐穆墒С５人幚碜饔谩ＥR床常用于治療中耳炎、皮膚感染、燒傷、慢性前列腺炎、急性細(xì)菌性痢疾、急性胃腸炎等病癥［1］。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明小檗堿是其主要成分之一。本實(shí)驗(yàn)主要利用正交設(shè)計(jì)研究纖維素酶、超聲波對(duì)黃柏中小檗堿提取量的影響。
1 材料與儀器
1.1 材料
黃柏購自沈陽東北大藥房，纖維素酶由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室自制。所用試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2 儀器
722-型光柵分光光度計(jì)（山東高密彩虹分析儀器有限公司），KQ3200DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司) 。
2 方法與結(jié)果
2.1 纖維素酶活力的測定
2.1.1 酶液配制準(zhǔn)確稱取500 mg纖維素酶，溶解后定容至100 ml容量瓶中，此酶液濃度為5 mg/ml。
2.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取100 mg分析純無水葡萄糖，用蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻。
2.1.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取8支20 ml刻度試管標(biāo)號(hào)后按表1加入各試劑。表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（略）
將上述溶液混勻后，在沸水浴中煮沸5 min，冷卻后定容至20 ml，搖勻。將分光光度計(jì)調(diào)零，在540 nm下測其A值。以每個(gè)試管中葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.1.4 樣品測定取4支20 ml刻度試管，分別依次加入0.5 ml 0.05M檸檬酸緩沖液（pH 4.5），向各試管中加入0.5 ml酶液，在其中一支試管內(nèi)立即加入1.5 ml 3，5二硝基水楊酸終止酶作用，作為空白與另3支試管一起在50 ℃水浴鍋中保溫1 h。取出后在后3支試管中加入3，5二硝基水楊酸，然后一起在沸水中煮沸5 min，冷卻后定容至20 ml。以空白液調(diào)零。在540 nm下比色，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出所測A值對(duì)應(yīng)的葡萄糖生成量。以上述條件，每小時(shí)由底物產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位。
2.1.5 濾紙酶活力計(jì)算濾紙酶活力（U/g） 依據(jù)公式：濾紙酶活力（U/g）=葡萄糖生成量（mg）×酶液定容總體積×5.56/［反應(yīng)液中酶液加入量（ml）×樣品重（g）×?xí)r間（h）］，1 mg葡萄糖換算成μmol：1 000 μg/180 μg=5.56 μmol，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測得，纖維素酶作用后，3個(gè)試管的A值為0.013，0.011，0.012。取其平均值為0.012，通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線查得葡萄糖生成量為0.123 mg帶入公式得： 濾紙酶活力=547.104 U/g
2.2 小檗堿的提取及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
2.2.1 粗提將黃柏5 g碎成粉狀，置燒杯中，加入1/10量的生石灰細(xì)粉，加水溶脹30 min后，再加入30倍量水浸泡24 h后紗布過濾，再用10 %的鹽酸將濾液pH值調(diào)至2～3，然后加入濾液體積10 %的NaCl，放置過夜后抽濾，得到鹽酸小檗堿的粗提物，此時(shí)還含有雜質(zhì)。將鹽酸小檗堿的粗提物用熱水溶解并趁熱抽濾，濾液冷卻靜止1 h抽濾得到鹽酸小檗堿與掌葉防己堿等的混合物，至此黃柏的粗提完畢［2］。
2.2.2 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取鹽酸小檗堿純品10 mg，置50 ml容量瓶中，加95 %的乙醇溶解并定容至刻度，作為鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取此液0.2，0.4，0.8，1.6，2.0 ml于50 ml容量瓶中，繼續(xù)加95 %乙醇至刻度并在348 nm下測定吸光度值，
y=0.805 5x-0.009 7。
2.3 纖維素酶-超聲波對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響取兩組黃柏各5 g，粉碎。在一組樣品中加入150 ml石灰水，在另一組中加入130 ml石灰水和20 ml濃度為5 mg/ml的酶液。第一組樣品浸泡24 h后雙層紗布過濾，第二組樣品在60 ℃，功率為60 %的超聲波清洗器里超聲清洗90 min后雙層紗布過濾，兩組濾液用10 %的鹽酸調(diào)pH 2～3，最后加入濾液體積10%的NaCl，放置過夜，抽濾，得兩組鹽酸小檗堿樣品。用乙醇溶解并分別定容至50 ml，在348 nm下分別測其吸光度值，并在鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出各自的鹽酸小檗堿。
2.4 提取條件的單因素考察
2.4.1 水浴溫度對(duì)提取效果的影響
稱取干燥的黃柏粗粉5 g左右，分別于 20，40，60，80，100 ℃時(shí)加入20 ml酶液，作用1.5 h，結(jié)果在60℃時(shí)提取量比較高。
2.4.2 水浴時(shí)間的確定
稱取干燥的黃柏粗粉5 g左右，于 60 ℃時(shí)加入20 ml酶液，分別作用0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，結(jié)果水浴1.5 h時(shí)提取量比較高。表2 纖維素酶-超聲波對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響（略）
2.4.3 加酶量的確定稱取干燥的黃柏粗粉5 g左右，于 60℃時(shí)加入酶液10，15，20，25，30 ml，分別作用1.5 h，結(jié)果加酶量為25 ml時(shí)提取量比較高。
2.4.4 超聲功率的確定稱取干燥的黃柏粗粉5 g左右，于 60℃時(shí)加入酶液20 ml，超聲時(shí)間1.5 h，超升功率分別為40 %，50%，60 %，70 %，80 %，結(jié)果超聲功率范圍為60 %時(shí)，提取量比較高。
2.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)黃柏中鹽酸小檗堿的提取條件，選定加酶量、溫度、時(shí)間、超聲功率4個(gè)因素，以L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因素水平見表3，正交表見表4。表3 因素及水平（略）表4 正交實(shí)驗(yàn)（略）
以上分析可以得出結(jié)論:各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)(含量)的影響按大小次序來說應(yīng)當(dāng)是C(水浴時(shí)間)、D(超聲功率)、A(加酶量)、B(水浴溫度)，最好的實(shí)驗(yàn)方案應(yīng)當(dāng)是C3A2D3B2，即水浴時(shí)間2.5 h， 超聲功率 80 %， 加酶 25 ml， 水浴溫度 60℃。
2.6 利用薄層色譜法檢測纖維素酶、超聲波對(duì)鹽酸小檗堿成分的影響制備硅膠薄層板一塊，取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)樣品、未用纖維素酶提取的鹽酸小檗堿樣品、用纖維素酶提取的鹽酸小檗堿樣品和用纖維素酶-超聲波提取的鹽酸小檗堿樣品各0.5μl，點(diǎn)樣。按CHCl3∶MeOH∶冰HAC=7∶1∶2的比例配制展開劑，將點(diǎn)樣后的薄層板放入層析缸中，待展開至規(guī)定距離時(shí)取出晾干。在可見與紫外燈下觀察，未用纖維素酶提取的鹽酸小檗堿樣品、用纖維素酶提取的鹽酸小檗堿樣品和用纖維素酶-超聲波提取的鹽酸小檗堿樣品薄層色譜圖相同。說明，用纖維素酶提取的鹽酸小檗堿的成分無變化。
3 討論
3.1 為什么纖維素酶不會(huì)影響鹽酸小檗堿的成分纖維素酶是一組能夠降解纖維素生成葡萄糖的酶的總稱。纖維素酶只是破壞黃柏細(xì)胞的細(xì)胞壁，其細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)并不含有纖維素類物質(zhì)，因此纖維素酶對(duì)其內(nèi)容物的成分沒有任何影響。所以，提取出來的鹽酸小檗堿的成分并不會(huì)變化。
3.2 為什么超聲提取會(huì)使黃柏中小檗堿的提取量增加且不影響其成分超聲提取法是基于超聲波的空化作用來加速物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的頻率和速度、增加溶劑穿透能力，以提高藥物溶出速度和溶出次數(shù)，從而有利于植物有效成分的浸出提取，而它的次級(jí)效應(yīng)，如機(jī)械振動(dòng)、乳化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速欲提取成分的擴(kuò)散釋放并充分與溶劑混合，有利于中藥中絕大部分有效成分的提取。超聲提取還避免了高溫加熱對(duì)有效成分的破壞。
【參考文獻(xiàn)】
關(guān)鍵詞：姜黃色素；酶輔助水提法；酶解溫度
中圖分類號(hào) S632.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2013）24-99-02
姜黃（Curcuma）屬姜科植物，又名色姜黃、子姜黃、寶鼎香，其味辛苦而性寒，入肝、膽、脾、胃經(jīng)。其盛產(chǎn)于我國南方，主要作為中藥材使用或作為天然色素原料出口。姜黃作為藥食兩用材料，還具有通經(jīng)行氣、活血降壓、驅(qū)寒消炎等效能[1]。
從植物姜黃的根莖中提取的姜黃色素，是一種食用天然黃色素。姜黃色素具有良好的染著性和分散性，其染色力大于其作用，是國內(nèi)外允許使用的重要的天然食用色素之一[2]，并具有熱穩(wěn)定性好、著色力強(qiáng)、色澤鮮艷等特點(diǎn)，在食品行業(yè)中被廣泛用作天然著色劑[3]，目前已被廣泛應(yīng)用于飲料、果酒、糖果、糕點(diǎn)、罐頭、果汁及烹飪菜肴中。
本文通過對(duì)酶量及酶解溫度的優(yōu)化，確定水酶法從姜黃中提取姜黃色素的工藝參數(shù)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料 姜黃：購于臨安康銳大藥房；鹽酸、氫氧化鈉：均為分析純；蒸餾水：自制；纖維素酶（80 000U）：為張家港金源牌產(chǎn)品；果膠酶（30 000U）：為無錫市雪梅酶制劑科技有限公司生產(chǎn)。
1.2 試驗(yàn)研究基本內(nèi)容 （1）單一酶用量的確定；（2）酶復(fù)合用量配比的確定；（3）酶解溫度的確定。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素實(shí)驗(yàn)
2.1.1 最適果膠酶用量的確定 由圖1可以看出：當(dāng)果膠酶量小于4%時(shí)，隨著果膠酶量的增加，吸光度值變化較大；當(dāng)果膠酶量超過4%后，吸光度值變化較小。在酶促反應(yīng)中，酶濃度越高水解越完全，但濃度過高吸光值增加反而不明顯。綜合考慮酶制劑成本，所以選擇4%的果膠酶加量。
2.1.2 最適纖維素酶用量的確定 由圖2可以看出：當(dāng)纖維素酶量小于0.4%時(shí)，隨著纖維素酶量的增加，吸光度值變化較大；當(dāng)纖維素酶量超過0.4%后，吸光度值變化較小。在酶促反應(yīng)中，酶濃度越高姜黃水解越完全，但濃度過高吸光值增加反而不明顯，綜合考慮酶制劑成本，所以選擇0.4%的纖維素酶加量。
圖1 果膠酶用量對(duì)吸光值的影響
圖2 纖維素酶用量對(duì)吸光值的影響
2.1.3 最適復(fù)合酶量的確定 由圖3可以看出：當(dāng)復(fù)合酶量小于3% 時(shí)，隨著復(fù)合酶量的增加，吸光度值變化較大；當(dāng)復(fù)合酶量超過3%后，吸光度值曲線逐漸趨于水平。在酶促反應(yīng)中，酶濃度越高反應(yīng)速度越快，但過高速度增加反而不明顯。綜合考慮酶制劑成本，所以選擇3%的復(fù)合酶量。
圖3 復(fù)合酶用量對(duì)吸光值的影響
2.1.4 最適酶解溫度的確定 由圖4可以看出：（下轉(zhuǎn)108頁）（上接99頁）在反應(yīng)的初始階段，隨著溫度的升高吸光值在增大，但超過50℃后，吸光值反而下降。低于50℃酶活不能充分發(fā)揮，酶反應(yīng)速度過低導(dǎo)致色素不能充分溶出。在此溫度范圍內(nèi)，溫度升高可提高反應(yīng)速度。超過此溫度酶逐漸失活，減少了參與反應(yīng)的分子數(shù)，反應(yīng)速度逐漸降低。由此酶解的最佳溫度為50℃。
圖4 酶解溫度對(duì)吸光值的影響
3 結(jié)論
本試驗(yàn)采用酶輔助水提法提取姜黃色素的最佳工藝參數(shù)是：纖維素酶用量為0.4%，果膠酶用量為4%，復(fù)合酶用量為3%，酶解溫度為50℃。
參考文獻(xiàn)
[1]楊云，馮衛(wèi)生.中藥化學(xué)成分提取分離手冊[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，1998.
[2]楊軍君，李湘洲，曠春桃，等.超聲-微波協(xié)同提取姜黃色素的研究[J].中國調(diào)品，2009，（5）：114.
【摘要】 目的：確定杜仲中多糖的酶法提取工藝。方法：用正交試驗(yàn)的方法分別研究果膠酶、中性蛋白酶和纖維素酶對(duì)杜仲多糖提取率的影響。結(jié)果：果膠酶增加多糖提取率效果最為顯著，其最佳提取條件是：酶加量0.10mg/L，酶處理溫度50℃，酶處理時(shí)間3h。其次是中性蛋白酶，纖維素酶的效果最差。結(jié)論：果膠酶可明顯增加杜仲多糖的提取率。
【關(guān)鍵詞】 杜仲；杜仲多糖；聚半乳糖醛酸酶；纖維素酶；正交試驗(yàn)
【ABSTRACT】 Objective:To study the effect of extraction rate from Eucommia ulmoides oliv polysaccharide by enzyme.Methods:It was investigated by orthogonal experiment design L9(34) on the influence of the extraction rate of Eucommia ulmoides oliv polysaccharide、neutral protein enzyme and cellulose enzyme.Results:The effectiveness of enzyme was the best.The optimal condition of extraction was when enzyme was as much as 10%，and 50℃ heat preservation up to 1h.The second was neutral protein enzyme，The cellulose enzyme was the last.Conclusion:The enzyme can increase the extraction rate of Eucommia ulmoides oliv polysaccharide.
【KEY WORDS】 Eucommia Ulmoides Oliv，EUCOMMAN，Polygalacturonase，Cellulase，Orthogonal Test
杜仲（Eucommia ulmoides oliv）是我國名貴的滋補(bǔ)藥材，具有降血壓、降血脂、降血糖、抗菌消炎、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗腫瘤等作用；含有苯丙素類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類、多糖類等多種物質(zhì)，杜仲多糖是一類天然的免疫增強(qiáng)劑，通過提高機(jī)體免疫力起到抗癌、抗腫瘤作用[1]。目前提取杜仲多糖主要是用水提醇沉法[2]和酸堿提取法，用水提取法時(shí)，多糖的得率較低，后處理過程較為繁瑣，而酸堿提取法又容易使多糖水解，破壞其活性結(jié)構(gòu)，有關(guān)酶法提取杜仲多糖的研究報(bào)道少見。本文參照有關(guān)文獻(xiàn)[3，4]，探討了果膠酶、中性蛋白酶和纖維素酶提取杜仲多糖的最佳條件，為杜仲的進(jìn)一步開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
1.1.1 儀器 UV754紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；XJ80離心機(jī)（江蘇醫(yī)療器械廠）；RE52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。
1.1.2 試劑 杜仲購于本院中醫(yī)門診部（于硅膠干燥器中干燥兩天后備用）；果膠酶、中性蛋白酶、纖維素酶（Fluka公司產(chǎn)品）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2 方法
1.2.1 多糖的提取方法 選取酶加量、酶處理溫度和酶處理時(shí)間三個(gè)因素。采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表，以多糖的提取率為指標(biāo)，作正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平見表1。表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表
因素水平酶加量
（mg/L）酶處理溫度（℃）果膠酶中性蛋白酶纖維素酶酶處理時(shí)間
（h）10.03455535120.07506040230.105565453
稱取杜仲0.5g于燒杯中，加入50倍量水，沸水浸提2h，離心取上清液，濃縮，定容后測定多糖含量，以該提取率為100%作對(duì)照，另稱取杜仲0.5g于燒杯中，加入10倍量水，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，加入酶。酶解后，再加入20倍水，沸水浸提2h，離心取上清液，定容后測定多糖含量，每個(gè)提取平行做3次。
1.2.2 多糖測定方法 采用苯酚—硫酸法測定總糖含量，采用3，5二硝基水楊酸法測定還原性糖含量。總糖含量減去還原糖含量即為多糖含量。
2009年6月劉曉河等：酶法提取杜仲多糖的工藝研究第3期2009年6月河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）第3期表2 果膠酶提取杜仲多糖的正交試驗(yàn)結(jié)果分析表3 中性蛋白酶提取杜仲多糖的正交試驗(yàn)結(jié)果分析
2 結(jié)果
按1.2.1多糖的提取方法進(jìn)行提取，再按1.2.2多糖的測定方法測定多糖含量。以不加酶時(shí)多糖的提取率為100%作對(duì)照。加入酶后增加的多糖提取率見表2、表3和表4。表4 纖維素酶提取杜仲多糖的正交試驗(yàn)結(jié)果分析
酶法提取杜仲多糖的試驗(yàn)結(jié)果表明，果膠酶增加多糖提取率的效果最明顯，最高處理組比對(duì)照組高4.1倍(見表2第8組），纖維素酶效果最差。三種酶提取杜仲多糖的關(guān)鍵因子與最佳提取條件見表5。表5 三種酶提取杜仲多糖的關(guān)鍵因子與最佳提取條件
3 討論
酶法可明顯增加杜仲多糖的提取率，這可能是因?yàn)槎胖僦谐撕卸嗵峭猓€含有纖維素、杜仲膠、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。這些物質(zhì)酶解后，有利于多糖類物質(zhì)的釋放，其中果膠酶增加杜仲多糖提取率的效果最為顯著，而纖維素酶的效果最差。這主要是因?yàn)槔w維素酶雖然提高了總糖的提取率，同時(shí)，使杜仲中的纖維素水解，更增加了還原糖的浸提率，導(dǎo)致多糖的提取率下降。
參考文獻(xiàn)
1 管淑玉，蘇薇薇．杜仲化學(xué)成分與藥理研究進(jìn)展[J]．中藥材，2003，26（2）：124129
2 劉軍海，任惠蘭，段玉蘭，等．杜仲葉多糖提取工藝研究[J]．食品科學(xué)，2007，28（7）：264267
關(guān)鍵詞 煙草；煙桿；纖維素酶；協(xié)同降解作用
中圖分類號(hào) Q93 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）11-0225-03
Abstract In order to reuse the waste tobacco stalk，several microbial strains can use waste tobacco rod high-temperature aerobic composting were screened，preliminary detection of several decomposed strains was conducted，and the further testing for strains synergistic effect of the combination and proportion was carried out.The results showed that three groups of degradation of tobacco stalk cellulose strains can grow in the culture medium which with tobacco stems as the sole source of nutrition，and has strong cellulose degradation ability，number of strains were H2568，B1，M1.Synergistic test indicated when biomass ratios of H2568，B1，M1 with 1.0∶1.0∶1.5，combination with the strongest degradation of the cigarette rod ability，the degradation rate of cellulose，hemicellulose degradation rate，lignin degradation rate reached 56%，70%，33%，the highest fiber prime enzyme activity reached 625.44 U/mL.
Key words tobacco；tobacco stalk；cellulase；synergistic degradation
煙草不僅是一種極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物，而且也是具有科研價(jià)值的一年生模式植物[1]。我國的煙草種植量和生產(chǎn)量穩(wěn)居世界首位，在煙草采收和運(yùn)輸?shù)倪^程中，大量的煙桿會(huì)被放棄或焚燒，即污染環(huán)境又造成資源浪費(fèi)[2-3]。如何再充分利用這些廢棄煙桿，成為目前迫切需要研究解決的課題。楊政明[4]、詹其厚[5]、張從軍[6]等利用煙桿中含有大量的氮、磷、鉀及微量元素的特性，利用廢棄煙草生產(chǎn)有機(jī)復(fù)合肥分別在核桃、夏玉米、水稻上施用取得了較好的肥效，并使農(nóng)作物產(chǎn)量顯著增加。但是又因煙桿中含有77.4%纖維素和半纖維素、18.63%木質(zhì)素[7]，顯著高于禾本科作物秸稈中木質(zhì)素含量，因此其難以被充分利用[8]。張楠[8]、周熠[9]對(duì)煙桿中纖維素進(jìn)行了降解并取得了不錯(cuò)的效果，但纖維素的降解率不到40%，理論上還有一定的提升空間。因此，本研究通過組合高效的好氧纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解組合菌群，考察其對(duì)煙桿的降解效果并優(yōu)化其組合比例，以便開發(fā)能夠利用廢棄煙桿制作高溫好氧堆肥的高效微生物菌劑[10]。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
本試驗(yàn)所有煙桿由中南煙草試驗(yàn)站提供。培養(yǎng)基：細(xì)菌培養(yǎng)基為0.5% NaCl，0.5%牛肉膏，1%蛋白胨，蒸餾水100 mL，pH=7；真菌培養(yǎng)基為綜合PDA瓊脂培養(yǎng)基（20%馬鈴薯提取液，2%葡萄糖，0.3% KH2PO4，0.15% MgSO4?7H2O，0.02%維生素B1，蒸餾水100 mL，pH=7）。煙桿選擇培養(yǎng)基為10%煙桿，蒸餾水100 mL，瓊脂粉2.0%，調(diào)pH值至7。煙桿液體發(fā)酵培養(yǎng)基為10%煙桿，蒸餾水100 mL，調(diào)pH值至7。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 菌種初步篩選。從土壤、腐熟的煙桿、剛屠宰的牛的胃部以及實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的纖維素降解菌中篩選能降解煙桿的菌種。將各菌株分別接種1環(huán)到2種種子液培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為25、37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵24 h后，各取種子液0.1 mL涂布在煙桿選擇培養(yǎng)基上，分別在25、37 ℃培養(yǎng)，3 d后觀察菌種生長情況。選擇能在煙桿選擇培養(yǎng)基上生長的菌種進(jìn)行下一步煙桿液體發(fā)酵試驗(yàn)。
1.2.2 不同菌株煙桿液體發(fā)酵試驗(yàn)。將各菌株種子液以10%的接種量接種到煙桿液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)酵10 d后以4 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL適量稀釋，用DNS法測定還原糖，選取還原糖含量較高的菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。
1.2.3 各菌拮抗性試驗(yàn)。將活力較高的菌株進(jìn)行兩兩拮抗性試驗(yàn)，利用抑菌圈法在蛋白胨、牛肉膏培養(yǎng)基（37 ℃）和PDA培養(yǎng)基（25 ℃）上培養(yǎng)24 h后，觀察菌株相互拮抗的情況。
1.2.4 不同組合菌煙桿液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)。將無明顯拮抗性作用的菌株做三菌種組合和四菌種組合發(fā)酵試驗(yàn)，把混合種子液于37 ℃、180 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，按接種量10%的煙桿液體發(fā)酵15 d，測定發(fā)酵液中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率，選出降解效率較高的4組菌種進(jìn)行下一步試驗(yàn)。
1.2.5 組合菌酶活力與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系。將選取的最佳組合菌在37 ℃、180 r/min條件下進(jìn)行煙桿液體發(fā)酵15 d，間隔測定發(fā)酵過程中的纖維素酶活力。
1.2.6 組合菌酶活力與發(fā)酵溫度的關(guān)系。將選取的最佳組合菌分別在40、50、60 ℃及其他條件不變的條件下發(fā)酵11 d，測定纖維素酶活力，判斷所選組合菌是否具有耐高溫性。
1.3 分析方法
1.3.1 纖維素、半纖維素、木質(zhì)素定量分析方法。通過測定還原糖的增加量可以初步挑選出更能高效降解煙桿的菌種，但是為了更詳細(xì)地了解煙桿中主要成分的降解情況[11]，下一步試驗(yàn)以纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率為主要試驗(yàn)指標(biāo)[12]。圖1為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素定量分析方法。
1.3.2 纖維素酶活性測定方法。取10 mL發(fā)酵液用離心機(jī)4 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL稀釋25倍制成待測酶液。取4支25 mL刻度具塞試管（2支平行管、1支空白管）。分別向所有管中加入CMC-Na溶液2.00 mL，再加入稀釋好的待測酶液0.50 mL（空白管不加），用漩渦混勻器混勻，蓋塞。（50.0+0.1）℃水浴30 min后，加入DNS試劑3.0 mL，于空白管中加入待測酶液0.50 mL，搖勻。沸水浴10 min后，迅速冷卻至室溫，用水定容至25 mL，以空白管調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長540 nm下，用10 mm比色杯分別測量樣品管中樣液的吸光度，取平均值。通過用線性回歸方程求出纖維素酶活[13]。
2 結(jié)果與分析
2.1 煙桿化學(xué)組成分析
首先對(duì)提供的樣品進(jìn)行了部分化學(xué)組成的檢測，尤其是對(duì)于纖維素類的物質(zhì)成分進(jìn)行了定量分析。在提供的煙桿樣品中，總纖維素含量達(dá)到77.44%，木素含量大約為18.63%，果膠含量為3.89%，苯-醇溶出物含量為3.21%，另外還有5%左右的灰分。可見，煙桿中含有豐富的纖維素類物質(zhì)資源，如果能夠?qū)@些纖維素降解后加以利用，完全可以提高煙桿廢棄物的利用價(jià)值。
2.2 纖維素菌的篩選
在篩選出來的微生物中有11組菌種能利用煙桿生長，將其分別編號(hào)為H2568、H1249、H1348、H1764、H4479、B1、M1、N1、Y1、Y2、Y3。進(jìn)行下一步煙桿液體發(fā)酵試驗(yàn)以確定所需纖維素菌。
2.3 纖維素菌的確定
初步篩選的11組菌株在降解煙桿多糖生成還原糖的能力上差異較為顯著。從圖2可以看出，這些微生物生成還原糖的量從高到低的順序依次為B1、M1、H2568、N1、H1249、H1348、Y3、H1764、H4479、Y2、Y1。選取其中降解能力最強(qiáng)的5株菌H1249、H2568、B1、M1、N1，作為下一步菌種協(xié)同降解作用的基礎(chǔ)進(jìn)行拮抗試驗(yàn)。
2.4 不同菌種拮抗結(jié)果
有很多試驗(yàn)研究表明，復(fù)合菌群較單一菌的降解能力強(qiáng)，特別是針對(duì)纖維素、木質(zhì)素等需多種酶協(xié)同降解的物質(zhì)，不同菌種組合起來可以起到補(bǔ)充和加強(qiáng)分解的作用。但在同一生長環(huán)境下，不同菌株之間產(chǎn)生拮抗性作用會(huì)抑制其自身生長和產(chǎn)酶活力。利用菌株之間不相容性，進(jìn)行拮抗性試驗(yàn)，從表1可以看出：H1249與B1拮抗，選取相對(duì)降解能力更強(qiáng)的B1。得到所需的4株無明顯拮抗性的菌株H2568、B1、M1、N1，可用于下一步菌種組合研究。
2.5 半纖維素、木質(zhì)素和纖維素的降解情況
在多菌株協(xié)同降解試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)H2568、B1和M1這3種菌種以等量進(jìn)行組合時(shí)能夠取得較好的降解效果（圖3），纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率分別達(dá)到了47%、63%、26%。因此，對(duì)煙桿纖維素降解效果最為理想的協(xié)同菌群組合確定為H2568+B1+M1。
2.6 組合菌酶活力與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系
將上述試驗(yàn)中確定的最佳組合菌H2568-B1-M1煙桿液體發(fā)酵15 d[14]，觀察其發(fā)酵過程中酶活力的變化情況（圖4），發(fā)酵第11天時(shí)，發(fā)酵體系中纖維素酶的活力最高，達(dá)到625.44 U/mL，隨后酶活力開始逐步降低。
2.7 組合菌酶活力與發(fā)酵溫度的關(guān)系
高溫對(duì)菌株的生長與產(chǎn)酶不利，但由于現(xiàn)階段煙桿大多處理方式為堆肥，那么固態(tài)發(fā)酵所需升溫過程不能避免，因此需要篩選出的組合菌能夠耐高溫來適應(yīng)固態(tài)堆肥。從圖5可以看出，在發(fā)酵11 d后，H2568-B1-M1的纖維素酶活不可避免的受到高溫影響，但是即使在60 ℃下仍能達(dá)到250.47 U/mL。組合菌耐高溫試驗(yàn)證明了H2568-B1-M1能長期保持較高的纖維素酶活力且耐高溫。
2.8 菌量比例對(duì)協(xié)同降解作用的影響
確定H2568、B1與M1為最佳的菌種組合后，對(duì)其接種時(shí)的比例進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。從圖6可以看出，H2568、B1與M1以1.0∶1.0∶1.5的比例組成煙桿發(fā)酵種子液時(shí)，取得了最佳效果。其纖維素降解率、半纖維素降解率、木質(zhì)素降解率分別達(dá)到56%、70%、33%，較1.0∶1.0∶1.0配比時(shí)的降解能力顯著提升。
3 結(jié)論與討論
煙葉產(chǎn)量的增加同時(shí)產(chǎn)生了大量的廢棄煙桿。由于煙桿不易腐爛也不能直接用于肥田，因而絕大部分都是作為廢棄物被丟棄或焚燒，這不僅不同程度地污染了當(dāng)?shù)氐纳钌a(chǎn)環(huán)境，也造成了資源的浪費(fèi)。經(jīng)試驗(yàn)證明通過微生物發(fā)酵將煙桿中的大分子物質(zhì)降解，將纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解為小分子的單糖，使卷煙制造產(chǎn)生的廢棄物轉(zhuǎn)化為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中急需的有機(jī)肥，具備廣闊的生產(chǎn)應(yīng)用前景。而煙桿中有機(jī)質(zhì)的降解依賴于微生物是否產(chǎn)生多種酶系和產(chǎn)各種酶系活力的強(qiáng)弱。基于纖維素酶的復(fù)雜性，大量試驗(yàn)證明，復(fù)合菌液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活力高于單菌株，在同一生長環(huán)境下，相互依賴，共同生長，達(dá)到良好的協(xié)調(diào)作用。因此，篩選出無明顯拮抗、耐高溫、長時(shí)間具備高酶活且能高效降解煙桿的組合菌是試驗(yàn)的基礎(chǔ)。在自然環(huán)境中常見的纖維素分解細(xì)菌大多為食纖維菌屬、生孢食纖維菌屬、多囊菌屬、鐮狀纖維菌屬與纖維弧菌屬。具有很強(qiáng)的纖維素分解能力的真菌主要有木霉、鐮刀霉、青霉、曲霉、毛霉、葡萄孢霉等屬的菌種。本試驗(yàn)前期篩選了多種能降解纖維素的細(xì)菌、真菌用于進(jìn)一步測試它們對(duì)煙桿的降解能力。因此，確定最佳的降解煙桿組合菌是為下一步研究提供了根本的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)中纖維素酶活力和還原糖的生成量能說明菌種自身降解能力的強(qiáng)弱，從另一角度總纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的變化情況反映了組合菌的降解效率。H2568-B1-M1以1.0∶1.0∶1.5的比例進(jìn)行煙桿液體發(fā)酵，11 d后其纖維素降解率、半纖維素降解率、木質(zhì)素降解率分別達(dá)到56%、70%、33%，說明經(jīng)H2568-B1-M1產(chǎn)生多種酶系，促進(jìn)了有機(jī)質(zhì)的降解，對(duì)煙桿的降解取得了較顯著效果，進(jìn)一步提高纖維素酶活力，增加還原糖的生成量，提高纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率，為進(jìn)一步進(jìn)行煙桿固體發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。
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關(guān)鍵詞：艾比湖；纖維素降解菌；酶活；Bacillus aquimaris菌株
中圖分類號(hào)：S182
文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：16749944（2017）10011304
1 引言
新疆艾比湖濕地國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)是中國內(nèi)陸荒漠物種最為豐富的區(qū)域之一，由于其特殊的地理位置，使得該地形成了沼澤、灘涂、鹽湖、沙漠、石漠、礫漠、鹽漠等多種土壤類型。依此而生的土壤微生物資源經(jīng)歷了長期的進(jìn)化演變，成為我國干旱區(qū)重要的種質(zhì)基因庫，具有典型性和較高的保護(hù)價(jià)值[1]。纖維素是地球上最豐富的碳質(zhì)資源之一，由于難以被大量分解利用，而被人們大量堆積或燃燒，從而對(duì)環(huán)境造成極大的污染和資源浪費(fèi)。如果能通過纖維素水解酶轉(zhuǎn)化利用，必將產(chǎn)生很好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益[2]。纖維素酶是由一系列酶系組成，濾紙是純纖維素材料，其聚合度和結(jié)晶度都比較適中，降解濾紙的濾紙酶（FPase）活性所代表的是纖維素酶的總活力，體現(xiàn)了纖維素酶系內(nèi)的協(xié)同能力。濾紙酶活力的測定主要依據(jù)纖維素酶水解濾紙產(chǎn)生還原糖的數(shù)量[3]。研究中試圖通過分離和篩選具有較高纖維素酶活性的菌株，為開發(fā)具有應(yīng)用前景的工業(yè)菌種做出貢獻(xiàn)。
2 材料與方法
2.1 供試土壤
試驗(yàn)土壤采自新疆北部艾比湖濕地國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的蘆葦?shù)睾图t柳地。采取距表層0～20 cm土壤約200 g，去除土壤中可見的動(dòng)植物殘?bào)w和石子，用自封袋封裝帶回實(shí)驗(yàn)室，過2 mm篩，立即進(jìn)行篩菌測酶活。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 纖維素降解菌篩選
稱取1.0 g 土樣到10 mL離心管中，加入無菌水9.0 mL 和幾粒無菌鋼珠，經(jīng)高速振蕩混勻后靜置，取上清液1 mL稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五個(gè)濃度梯度。取100 μL涂布于培養(yǎng)基上，30℃ 恒溫倒置培養(yǎng)24 h后，用牙簽挑取形態(tài)有差異的單菌落，接種到固體平板培養(yǎng)基上，用于純化后測序鑒定。
另取上清液1 mL加入液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床120轉(zhuǎn)/min，30℃富集三代后，劃線接種在固體培養(yǎng)基上，24 h后，用牙簽挑取形態(tài)有差異的單菌落（產(chǎn)外切葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶的菌落有透明水解圈，產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌落周圍有黑圈），接種到固體平板培養(yǎng)基上，用于純化后測序鑒定。
注意：液體培養(yǎng)基不加顯色劑和瓊脂。
2.2.2 纖維素酶活測定
（1）濾紙酶（FPase）。取100±0.5 mg濾紙與1 mL菌液于10 mL比色管中，加入pH值為4.8，0.1 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液l mL，50℃水浴酶解反應(yīng)1 h后取出，迅速冷卻至室溫。
（2）內(nèi)切β-1.4-葡聚糖酶（CMCase）。取2 mL CMC-Na溶液與1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反應(yīng)1 h后取出，迅速冷卻至室溫。
（3）外切β-1.4-葡聚糖酶（Avicelase）。取2 mL微晶纖維素溶液與1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反應(yīng)1 h后取出，迅速冷卻至室溫。
（4）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）。取2 mL水楊苷溶液與1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反應(yīng)1 h后取出，迅速冷卻至室溫[4]。
酶促反應(yīng)結(jié)束之后，立即加入0.8 mL DNS 試劑，沸水浴5 min之后取出，迅速冷卻至室溫，用水定容10 mL。在530 nm波長處測定吸光度OD 值，對(duì)照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葡萄糖量P。以高溫滅活的粗酶液為對(duì)照組。
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取10 mL比色管6支，加入1.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.16、0.32、0.48、0.64、0.8 mL，加蒸餾水0.8、0.64、0.48、0.32、0.16、0.0 mL，加DNS試劑0.8 mL，混勻后煮沸5 min，取出立即用冷水冷卻，用水定容至10 mL，搖勻，530 nm測吸光度OD值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
酶活定義：底物在一定反應(yīng)條件（pH值為4.8，50℃，恒溫l h）下，與1 mL粗酶液反應(yīng)1 min生成1 μg葡萄糖為1個(gè)酶活單位（U/mL）。
計(jì)算：酶活力（U/mL）=P×K×1000/時(shí)間*體積，其中K為稀釋倍數(shù)。
2.3 稻荽理
利用Excel 2003，Origin 8.0和SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析及繪圖。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。
3 結(jié)果與分析
3.1 菌株的篩選結(jié)果
采用3種培養(yǎng)基和常規(guī)的分離技術(shù)對(duì)土樣中的纖維素降解菌進(jìn)行初步篩選，分離。然后對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA測序，獲得序列后，在NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，經(jīng)過比對(duì)的結(jié)果如表1。
經(jīng)過初篩分離純化后，共得到74株菌，屬26個(gè)種。篩到的厚壁菌門Firmicutes 芽孢桿菌屬Bacillus 細(xì)菌最多有14個(gè)種。Bacillus是一類好氧或兼性厭氧、能產(chǎn)生抗逆性孢子的桿狀細(xì)菌。多數(shù)為腐生菌，主要分布于土壤、動(dòng)植物體表及水體中。由于芽孢桿菌屬的細(xì)菌可以產(chǎn)生多種有用代謝產(chǎn)物，芽孢又是菌體度過不良環(huán)境的休眠體，因此，在工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有較高的應(yīng)用價(jià)值[5]。例如枯草芽孢桿菌是工業(yè)上生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶的主要菌種，蘇云金芽孢桿菌用于生產(chǎn)生物農(nóng)藥，巨大芽孢桿菌能提高土壤有效磷的含量等。Bacillus aquimaris能利用羧甲基纖維素鈉，水解淀粉，耐鹽[6]。Bacillus aryabhattai可以利用纖維二糖，促進(jìn)植物生長，具有溶磷作用、產(chǎn)植物激素。Bacillus litoralis采自海水淤泥，利用纖維二糖和醋酸纖維素，水解淀粉。Bacillus oceanisediminis具有硝酸鹽還原作用，還能利用纖維二糖、醋酸纖維素。Bacillus firmus能富集鉻、砷，或用于生物修復(fù)[7]。Bacillus vietnamensis中等耐鹽、產(chǎn)氧化酶，抗溶菌酶（區(qū)別于B.firmus）。可在pH值為4.5和9.0的環(huán)境生長，不同于B.aquimaris。Altererythrobacter xinjiangensis能水解酪蛋白和纖維素，可利用葡聚糖。Arthrobacter nicotianae降解尼古丁，脫硫，聚磷。Planococcus rifietoensis產(chǎn)纖維素酶、脫氨酶，促進(jìn)植物生長（固氮，溶磷作用，產(chǎn)吲哚乙酸）[8]。Microbacterium amylolyticum有一定聚乙烯降解作用。Streptomyces coelicoflavus能降解纖維素，還原硝酸鹽[9]。
3.2 纖維素酶酶活測定
選取其中水解圈較大的8株菌進(jìn)行纖維素酶活測定（表2）。分別測定了濾紙酶（FPase）、內(nèi)切葡聚糖酶（CMCase）、外切葡聚糖酶（Avicelase）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）的酶活。
由圖1可知，菌株13C12、03C5、05B2的濾紙酶活顯著高于其它，其中13C12的酶活最高達(dá)21.4 U/mL。菌株MZ2、03C9、13C3的酶活次之，約為3.2 U/mL。菌株132和13A4的濾紙酶活最低。
4 結(jié)論與討論
（1）經(jīng)過初篩分離純化后，共得纖維素降解菌到74株菌，屬26個(gè)種。篩到的厚壁菌門Firmicutes 芽孢桿菌屬Bacillus 細(xì)菌最多，有14個(gè)種。
（2）菌株13C12的纖維素酶活最高。濾紙酶（FPase）活為21.4 U/mL，內(nèi)切葡聚糖酶酶活達(dá)37.4 U/mL，外切葡聚糖酶（Avicelase）為19.2 U/mL，β-葡萄糖苷酶酶活為24.6 U/mL。
（3）接種量的多少會(huì)影響產(chǎn)纖維素酶菌株在發(fā)酵液中的生長、代謝和繁殖速度。選擇較大的接種量可以縮短發(fā)酵液內(nèi)菌體密度達(dá)到高峰的時(shí)間，有利于產(chǎn)物的形成以及培養(yǎng)基質(zhì)的利用，并減小被雜菌污染的概率。然而接種量過大則會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中溶氧不足，限制a物的合成，菌體易老化；接種量過小則會(huì)延長發(fā)酵周期，影響產(chǎn)率。
（4）由于許多土壤細(xì)菌生活力較差，樣本采集回來后應(yīng)盡快篩菌，否則，擱置時(shí)間過長會(huì)嚴(yán)重影響篩菌的效率和成功率。此外，土壤細(xì)菌大多數(shù)不可培養(yǎng)，通過傳統(tǒng)篩菌方法篩到的菌落有限，所以探尋新的實(shí)驗(yàn)方法具有重要意義。
致謝：中國科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室周杰民博士對(duì)本實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)過程中的支持；感謝新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第五師農(nóng)科所的工作人員在采樣過程中的幫助。
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關(guān)鍵詞：纖維素乙醇；木質(zhì)纖維素；產(chǎn)業(yè)化；生物精煉；乙醇聯(lián)產(chǎn)
Abstrct：With the energy crisis and environmental problems? becoming increasingly prominent， world energy development is entering a new period .That is， the world is experiencing the revolution that the energy? is being restructured from fossil energy consumption to focusing mainly on the renewable energy revolution. Cellulose ethanol is been the best alternative liquid fuel and industrial biotechnology research focuses on ecological benefits. In this paper， the authors summarize the status of cellulose ethanol at home and abroad， and analyz the impact? factors? affecting cellulose ethanol industry development and the development trend of the cellulose ethanol industry .
Key words：Cellulose ethanol ;lignocellulose; industrialization ;bio-refining ;co-production of ethanol
0引 言
能源問題是當(dāng)今世界各國都面臨的關(guān)系國家安全和經(jīng)濟(jì)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的中心議題，已經(jīng)成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。因此，人們開始把目光轉(zhuǎn)移到有利于社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的可再生能源體系。專家認(rèn)為，生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化體系是引領(lǐng)第三次世界能源革命的技術(shù)平臺(tái)。在此背景下，燃料乙醇已經(jīng)被視為替代和節(jié)約汽油的最佳燃料，其高效的轉(zhuǎn)換技術(shù)和潔凈利用日益受到全世界的重視，已經(jīng)被廣泛認(rèn)為是21世紀(jì)發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟(jì)的有效途徑。
在中國，燃料乙醇的主要原料是玉米和小麥。隨著燃料乙醇的快速發(fā)展，原料問題日益突出，成為制約燃料乙醇發(fā)展的瓶頸；另外，以糧食作物為原料的燃料乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展還有可能引發(fā)國家糧食安全問題。因此，中國政府提出生物乙醇堅(jiān)持非糧之路，即“不與人爭糧，不與糧爭地”。經(jīng)濟(jì)分析顯示，中國發(fā)展纖維素乙醇有更大的優(yōu)勢。木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源，也是當(dāng)前利用率最低的資源，是各國新資源戰(zhàn)略的重點(diǎn)。中國可利用的木質(zhì)纖維素每年在7億噸左右，這些豐富而廉價(jià)的自然資源主要來源于農(nóng)林業(yè)廢棄物、工業(yè)廢棄物和城市廢棄物。所以，纖維素乙醇是未來發(fā)展的必然方向。
1木質(zhì)纖維素原料組成及性質(zhì)
木質(zhì)纖維素是由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和少量的可溶性固形物組成。纖維素大分子是由葡萄糖脫水，通過β-1，4葡萄糖苷鍵連接而成的直鏈聚合體。在常溫下不發(fā)生水解，高溫下水解也很緩慢。只有在催化劑的作用下，纖維素的水解反應(yīng)才顯著進(jìn)行。常用的催化劑是無機(jī)酸或纖維素酶，由此分別形成了酸水解和酶水解工藝。半纖維素是由不同的多聚糖構(gòu)成的混合物，這些多聚糖由不同單糖聚合而成，有直鏈也有支鏈，上面連接有不同數(shù)量的乙酰基和甲基。半纖維素的水解產(chǎn)物主要有己糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、戊糖和阿拉伯糖等幾種不同的糖。半纖維素的聚合度較低，相對(duì)比較容易降解成單糖。二者的水解機(jī)理可以用下列方程式簡單地表示：
(C6H10O5)n + nH2OnC6H10O6
(C5H804) n + nH2OnC5H10O5
2國外纖維素乙醇的研究與應(yīng)用現(xiàn)狀
隨著現(xiàn)代工業(yè)的迅速發(fā)展，大規(guī)模開發(fā)利用作為清潔能源的可再生資源顯得日益重要。許多國家都制定了相應(yīng)的開發(fā)研究計(jì)劃，例如：美國的“能源農(nóng)場”、巴西的“酒精能源計(jì)劃”、印度的“綠色能源工程”和日本的“陽光計(jì)劃”等發(fā)展規(guī)劃。其它諸如丹麥、荷蘭、德國等國，多年來一直在進(jìn)行各自的研究與開發(fā)，并形成了各具特色的生物質(zhì)能源研究與開發(fā)體系，擁有各自的技術(shù)優(yōu)勢。
自1973年世界石油危機(jī)后，巴西就實(shí)施了“國家乙醇生產(chǎn)計(jì)劃”，主要依靠本國豐富的甘蔗資源，積極發(fā)展燃料乙醇產(chǎn)業(yè)，目前已經(jīng)發(fā)展320多家燃料乙醇生產(chǎn)企業(yè)，1400萬噸/年的乙醇生產(chǎn)規(guī)模。大部分企業(yè)實(shí)行燃料乙醇和糖聯(lián)產(chǎn)。美國在燃料乙醇的生產(chǎn)上仍然是世界乙醇生產(chǎn)的領(lǐng)頭羊，在將纖維素轉(zhuǎn)化為燃料酒精的研究、生產(chǎn)和應(yīng)用方面也走在世界的前列。美國加州大學(xué)Berkeley分校采用的流程是纖維素水解與發(fā)酵同步進(jìn)行，該工藝以粉碎的玉米芯為原料，再用稀酸水解，將半纖維素水解成木糖等產(chǎn)物。該流程的酸水解是連續(xù)進(jìn)行的，反應(yīng)器中的纖維原料含量為5%，玉米芯水解率達(dá)40%，水解液中糖為2.6%，然后采用多效蒸發(fā)器濃縮至糖濃度為11%再進(jìn)行發(fā)酵。美國維吉尼亞州立大學(xué)利用80%的濃磷酸循環(huán)使用進(jìn)行木質(zhì)纖維素“溶解性分離”的研究，然后經(jīng)纖維素酶水解，得到較純的葡萄糖，其得率達(dá)到35%。瑞典隆德大學(xué)Karin Ohgren等研究了將蒸汽爆破預(yù)處理后的玉米秸稈進(jìn)行同步糖化與發(fā)酵的工藝研究，試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵結(jié)束后乙醇達(dá)到25g/L。
近年，隨著纖維乙醇技術(shù)的快速發(fā)展，一些大公司開始計(jì)劃建造較大規(guī)模的試驗(yàn)性工廠。美國的Gulfoil Chemical公司建成了可處理1t/d纖維廢料的中試車間，年產(chǎn)純乙醇2億升，乙醇產(chǎn)率為27.7%。加拿大的Iogen生物技術(shù)公司，在渥太華開設(shè)了以麥秸為原料的3.2萬加侖/年纖維素乙醇廠，采用稀酸結(jié)合蒸汽氣爆預(yù)處理半纖維素，隨后用纖維素酶水解，分離后的液體進(jìn)行木糖和葡萄糖聯(lián)合發(fā)酵。經(jīng)評(píng)估，其生產(chǎn)成本比谷物乙醇高出30%～50%。
3國內(nèi)纖維素乙醇研究與應(yīng)用現(xiàn)狀
我國在纖維素乙醇技術(shù)開發(fā)上也取得了一些重要進(jìn)展。浙江大學(xué)主持的“利用農(nóng)業(yè)纖維廢棄物代替糧食生產(chǎn)酒精”的項(xiàng)目已在河北完成中試生產(chǎn)，以玉米芯為原料，乙醇產(chǎn)率為22.2%（W/W）。南京林業(yè)大學(xué)建立了玉米秸稈間歇蒸汽爆破預(yù)處理、纖維素酶水解和戊糖己糖同步發(fā)酵技術(shù)制取纖維乙醇的中試裝置。水解得率為71.3%，還原糖利用率和乙醇得率分別為87.17%和0.43%。華東理工大學(xué)于2005年已建成了纖維乙醇600噸/年的示范性工廠，以廢木屑為原料，以稀鹽酸水解和氯化亞鐵為催化劑的水解工藝以及葡萄糖與木糖的發(fā)酵，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了70%。河南農(nóng)業(yè)大學(xué)利用黃胞原毛平革菌和雜色云芝的復(fù)合預(yù)處理，對(duì)選擇性降解木質(zhì)素的能力和規(guī)律進(jìn)行了試驗(yàn)研究。生物降解后原料水解率達(dá)到了36.67%。山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主要開展“纖維素原料轉(zhuǎn)化乙醇關(guān)鍵技術(shù)”研究。對(duì)纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選和誘變育種、用基因手段提高產(chǎn)酶量或改進(jìn)酶系組成、纖維素酶生產(chǎn)技術(shù)等研究。吉林輕工業(yè)設(shè)計(jì)研究院“玉米秸稈濕氧化預(yù)處理生產(chǎn)乙醇”在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模為10L發(fā)酵罐條件下，經(jīng)濕氧化預(yù)處理和酶水解后酶解率86.4 %；糖轉(zhuǎn)化為乙醇產(chǎn)率48.2 %。
近年來，以河南天冠集團(tuán)和中糧集團(tuán)為代表的幾家大型燃料乙醇生產(chǎn)企業(yè)，與高校聯(lián)合進(jìn)行纖維素乙醇的工業(yè)化技術(shù)的探索性研發(fā)。目前，河南天冠集團(tuán)將建成300噸/年的乙醇中試生產(chǎn)線，原料轉(zhuǎn)化率超過了16%。中糧集團(tuán)于2006年在黑龍江肇東啟動(dòng)建設(shè)500噸/年纖維素乙醇實(shí)驗(yàn)裝置。吉林九新實(shí)業(yè)集團(tuán)建立了3000噸/年的玉米秸稈生產(chǎn)纖維乙醇示范性工廠。
迄今為止，全世界已經(jīng)建有幾十套纖維質(zhì)原料經(jīng)纖維素酶水解成單糖的中試生產(chǎn)線或小試生產(chǎn)線。纖維燃料乙醇在國內(nèi)外研究正步入一個(gè)新的時(shí)代，在一些關(guān)鍵技術(shù)上取得了重要的進(jìn)展，并建立了多個(gè)示范性工廠。但整體上，由于在纖維素酶生產(chǎn)技術(shù)、戊糖己糖發(fā)酵菌株構(gòu)建等方面還沒有取得根本性的突破，所以距離纖維素乙醇的產(chǎn)業(yè)化還有一定的距離。
4影響纖維乙醇產(chǎn)業(yè)化的主要因素
近年來，國內(nèi)外對(duì)利用木質(zhì)纖維轉(zhuǎn)化乙醇進(jìn)行了大量的研究， 工藝路線已經(jīng)打通，但當(dāng)前要想實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，在原料收集、預(yù)處理、糖化、發(fā)酵和精餾各工藝過程中還存在著制約纖維素乙醇生產(chǎn)的問題，主要表現(xiàn)為以下四個(gè)方面
（1）木質(zhì)纖維素原料分散，季節(jié)性強(qiáng)，尤其是農(nóng)作物秸稈。
（2）木質(zhì)纖維素預(yù)處理技術(shù)有待進(jìn)一步優(yōu)化和提高。由于天然纖維素原料的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的特性，使得其纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三者不能有效分離；另外伴隨產(chǎn)生一些中間副產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)表明，這些物質(zhì)抑制酵母的生長和代謝，最終影響乙醇產(chǎn)率。
（3）缺乏高效的纖維酶菌株，現(xiàn)有的纖維素酶制劑效果較低，使得酶解糖化經(jīng)濟(jì)成本較高，當(dāng)前生產(chǎn)一噸纖維乙醇需要酶制劑成本在2200～2600元。
（4）缺乏能夠同時(shí)高效利用戊糖和己糖的發(fā)酵菌株。在木質(zhì)纖維水解中，其中有相當(dāng)比重的木糖（葡萄糖/木糖約為2）。因此，戊糖的利用是影響纖維乙醇綜合成本的關(guān)鍵一項(xiàng)。
5未來纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化發(fā)展趨勢
目前，國外纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化的研究已經(jīng)成為了熱潮，正步入一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，中國在這方面也有良好的基礎(chǔ)。為了使纖維素乙醇盡早地實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，除了以上幾項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)一步解決好外，還應(yīng)當(dāng)借鑒石油化工的經(jīng)驗(yàn)，堅(jiān)持走生物精煉和乙醇聯(lián)產(chǎn)的模式，盡可能地最大提升和拓展底物的各組分的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也許是促使纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化的重要途徑。
盡管木質(zhì)纖維素原料本身非常廉價(jià)，但是將其轉(zhuǎn)化成乙醇的工藝過程非常復(fù)雜，需要大量的能耗。這主要是由木質(zhì)纖維素自身的結(jié)構(gòu)特性決定的，而得到的目標(biāo)產(chǎn)物是經(jīng)濟(jì)附加值并不很高的乙醇，致使單位乙醇的經(jīng)濟(jì)效益并不具備較強(qiáng)的市場優(yōu)勢。而生物精煉和乙醇聯(lián)產(chǎn)模式就打破了原來由生物質(zhì)生產(chǎn)單一產(chǎn)品的觀念，實(shí)現(xiàn)原料充分利用和產(chǎn)品價(jià)值最大化，就是所謂的“吃干榨凈”，正如目前的利用糧食生產(chǎn)乙醇一樣。例如，利用玉米同時(shí)生產(chǎn)燃料乙醇、玉米油、蛋白粉、高果糖漿、蛋白飼料和其他系列產(chǎn)品，這樣提升了整個(gè)工藝產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)附加值，同時(shí)取得良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。同樣利用木質(zhì)纖維素的三大類組分也可以衍生出多種產(chǎn)品。例如：目前，大多的木糖醇廠主要是利用玉米芯中的半纖維素生產(chǎn)木糖醇，結(jié)果剩下大量的木糖渣（主要是纖維素和木質(zhì)素），如果進(jìn)行聯(lián)產(chǎn)模式，將剩下的纖維素與木質(zhì)素進(jìn)行組分分離，分別生產(chǎn)纖維乙醇和優(yōu)質(zhì)燃料或木素磺酸鹽，就有可能進(jìn)一步提升產(chǎn)品的綜合效益。
綜上所述，中國應(yīng)該利用纖維素乙醇作為主要的生物能源，加快以纖維素乙醇為核心的綜合技術(shù)開發(fā)，盡早實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的目標(biāo)。相信經(jīng)過“十一五”計(jì)劃的實(shí)施，中國在利用纖維素廢棄物制取燃料乙醇方面，必將取得更大的進(jìn)展，為緩解液體燃料短缺、促進(jìn)環(huán)境保護(hù)和社會(huì)可持續(xù)發(fā)展等方面發(fā)揮重要作用。
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