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開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇熱休克蛋白，希望這些內容能成為您創作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進步。
關鍵詞:熱休克蛋白;結構;功能;針灸;中藥
中圖分類號:R456 文獻標識碼:A 文章編號:1673-7717(2010)04-0718-03
Comparison of Different Heat Shock Proteins and Their Relationship with the Chinese Medicine
HUANG Yun,Advisor:LING Yaping
(Department of Acu-moxibustion and Massage,Hunan College of Chinese Medicine,Changsha 410208,Hunan,China)
Abstract:Heat shock protein is a group of highly conserved protein molecules family who has important physiological functions. Physiology, pathology and environmental factors can be induced by heat shock protein production, it is also known as stress proteins. According to molecular size and degree of homology, HSPs can be divided into HSP110, HSP90, HSP70, HSP60, small molecular HSP family of five major. Current,We studied HSP90, HSP70 most, but few on the HSP110. HSPs have much in common, but each HSP family has a unique structure and function. HSPs can protect the body , so try to find a no toxic side effects of HSPs induction agent or method has become an active area of research at home and abroad. Acupuncture and Chinese medicine of Traditional Chinese Medicine can affect the expression of HSPs.We make a review aboutthe structure、function of the HSPs and the relationship with Chinese medicine.
Key words:heat shock protein ; structure; function ; acupuncture Chinese medicine
收稿日期:2009-11-11
基金項目:國家自然科學基金資助項目(30772707 )國家教育部博士點科研基金資助項目(20070541003)
作者簡介:黃蕓(1984-),女,湖南耒陽人,碩士研究生,研究方向:經脈臟腑相關機理研究。
通訊作者:林亞平(1956-),女,湖南長沙人,教授,碩士研究生導師,研究方向:經脈臟腑相關機理研究。
熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是Ritossa在1962年首先發現的,當時在研究果蠅唾液腺染色體時發現一種在細胞高溫應激時能產生對細胞有保護作用而且高度保守的蛋白質[1]。HSPs每個家族針對不同的亞細胞結構都有組成性和誘導性表達,如HSP60和HSP90在哺乳動物中為組成性表達,而HSP70和HSP27在受到高熱、氧化應激或抗癌藥物刺激時的高表達為誘導性表達。
HSPs的功能[2]主要有 :①維持細胞蛋白自穩。②“分子伴侶”作用。③提高細胞對應激原的耐受性。④參與免疫調節,增強免疫功能。⑤既有直接的神經元保護作用,又可誘導其他保護性機制的產生,直接或間接參與神經元的自身保護。⑥參與細胞周期的調節。
HSPs的分子生物學特性[3]:①生物界的普遍性。自然界所有的原核和真核生物都有HSP。②高度保守性。不同物種有同源性很高的HSP,其中氨基酸序列有50%～90%的一致性, 但不同家族HSPs之間則無明顯序列同源性。③非特異性。除熱環境以外,其他的物理、化學及生物應激原,如缺血、缺氧、感染、創傷、重金屬離子、氧自由基等均可誘導HSPs的產生。④交叉耐受性。是指一種應激刺激誘導細胞產生HSPs后,不僅使細胞對該刺激的耐受性增加,也增加了細胞對其他應激原刺激的耐受性。⑤模擬性。指能以分子模擬宿主自身抗原,兼具迷惑宿主與致病的兩重性。⑥雙重性。指有自身抗原和特異抗原,能引起抗感染免疫及腫瘤防護,又能誘導多種自身免疫病及感染炎癥。
除了上述的共同特點外,各個熱休克蛋白家族又有獨特的結構、功能及生物學特性。
HSP90:HSP90家族成員主要有HSP90α、HSP90β和gp96(Grp94)。HSP90 在胞漿內主要以同源二聚體的形式存在,每個同源二聚體又由2 個單體構成。HSP90 單體包括3 個主要的結構域:由1個保守的25×103的N 末端結構域和1個55×103的C末端結構域和1個中間結構域[4]。其N端結構域是結合底物蛋白結構域,類似蛋白酶結合底物口袋,C端為寡聚化結構域[5]。HSP90是胞漿蛋白,它通過與靶蛋白的活集團的結合,使其維持所謂“無活性穩態”。HSP90通常可逆性地結合并穩定胞漿中受體分子的活性結合位點,從而避免這些結構與胞漿中的其它生物分子形成聚合體而失活[6]。在抑制細胞凋亡、促進細胞存活上,HSP90主要作用于抑制IκB降解的各個通路上。HSP90能直接與Akt相互作用,抑制它的去磷酸化。磷酸化的Akt能使Bcl-2家族的Bad和caspase-9磷酸化,使它們的活性受到抑制,促進細胞存活。
HSP90作為HSPs 重要成員之一,在腫瘤中研究和應用最多。HSP90在腫瘤細胞中主要處于活化態,而在正常細胞中則主要處于靜默態。pp60v2src 是第一個被發現能與HSP90 作用的原癌基因,它能夠與HSP90 形成HSP902pp60v2src復合體。P53基因突變是至今已知的與人類癌癥相關的最普遍的基因異常, HSP90 也能夠和突變型p53 特異性結合,導致突變型p53 復合體的積聚和半衰期的延長[7]。HSP90 還參與腫瘤血管的生長、侵襲及轉移。研究表明抑制HSP90 的功能可對腫瘤達到“多點攻擊”,達到抑制腫瘤的生長和轉移。HSP90抑制劑可以通過特異性抑制HSP90 阻斷腫瘤生長轉移信號網絡通路中的多個靶點,還能逆轉腫瘤的耐藥性,使腫瘤對化療藥物敏感性增加。HSP90及其抑制劑是目前抗腫瘤研究的熱點和前沿[8]。
HSP70:HSP70家族包括GRP75,GRP78,BIP,HSP68,HSP72,HSC70等。根據表達形式的不同可分為結構型和誘導型兩種:HSC70固定表達存在于胞液與細胞核中,被稱為結構型HSP70;誘導型HSP70(又稱為HSP72或HSP70)為高度應激所誘導。通常所指的HSP70即誘導型HSP70[9]。HSP70蛋白由兩部分組成,即ATP酶區(AT-Pase domain)和底物識別區或叫多肽結合區(pep-tide-binding domain)[10]。HSP70是膜結構相關蛋白,其生物學作用主要是結合靶蛋白的疏水片斷而防止肽鏈的錯誤盤繞。在細胞受到環境變化和有害刺激時,細胞的一部分結構和功能蛋白發生變性,在正常狀態下處于分子內部的疏水片斷暴露“外化”,而形成不穩定的空間結構。HSP70則通過與這些疏水片斷的結合而穩定其結構,并通過復雜的分子間相互作用,利用水解ATP的能量,協助變性蛋白的復性[11]。在控制細胞凋亡中,HSP70高表達能抑制caspase的激活、線粒體的損傷和核斷裂。可以通過直接或間接地抑制MEK激酶抑制JNK的磷酸化,還可作為天然的抑制蛋白結合到JNK,抑制其活性,從而抑制JNK細胞凋亡通路。
HSP70是HSPs中反應最為敏感研究最多最深入的。在臨床上,HSP70與癲癇、心腦缺血、多發性硬化、感染、腫瘤等多種疾病關系密切。在腦血管病和心血管病中對心肌細胞和腦細胞有顯著的保護作用,減少細胞缺血壞死范圍,修復損傷蛋白質,提高細胞對缺血的耐受性[9,12]。急性腦創傷后在易受損傷區域的神經元HSP70的轉錄表達,能減少神經細胞凋亡,有助于延遲神經細胞的死亡,與神經保護關系最為密切[13-14]。HSP70可與突變型P53形成穩定復合物,從而使核內P53轉移到胞漿中,喪失了控制細胞增殖的能力。HSP70可以激發抗腫瘤細胞的特異性反應,結合細胞內的全部異常肽庫,因此HSP70 - 肽疫苗可以是多價的,這有利于防止免疫逃逸從而增強免疫效果,為腫瘤疫苗開發提供了新的思路。
HSP60:真核生物的HSP60主要位于線粒體內(約70～80%),另有小部分位于胞漿。此外, HSP60存在于某些細胞的分泌顆粒中,例如胰島的β細胞。HSP60是線粒體內最主要的分子伴侶蛋白之一,它與HSP10組成的高分子量聚合物被形容為“巨型呼吸器”,是線粒體基質蛋白折疊和修復系統的關鍵組成部分。人類HSP60與其分子伴侶HSP10的基因頭對頭位于2號染色體上,兩個基因之間有雙向啟動子,啟動子中則含有熱休克元件,接受熱休克轉錄因子的調控[15]。正常條件下,HSP60以穩定狀態存在于細胞質和線粒體基質中,維護抗凋亡因子的正常構象和功能;應激條件下,HSP60迅速從胞質中轉移到線粒體基質以修復線粒體基質中的變性蛋白,對促凋亡因子產生保護和協同作用[16]。因此,HSP60有抗凋亡和促凋亡的雙向調整作用。它的這種抑制或者促進作用可能與細胞種類、所受刺激類型、細胞狀態、HSP60含量和活性等多種因素有關。HSP60 是一種T細胞信號,壓抑或禁止化學反應,其中Peptide (p277) 是它的一個24個氨基酸片段,首先在非肥胖型糖尿病大鼠體內發現的一種抗原,p277能阻止先天的或適應性T細胞受體對B 細胞的損害,從而對1型糖尿病有治療作用[17]。
sHSP:小熱休克蛋白(small heat shock protein,sHSP)幾乎存在于所有生物體中,其主要結構是由N端域和C端域2個部分組成,C端域含有一個相當保守的α晶體蛋白(α-crystallin)結構域,由約90個氨基酸殘基組成,與其相鄰的是可變的N端域。小熱休克蛋白家族成員的共同特點是特殊絲氨酸殘基上的磷酸化,磷酸化作用會導致sHSP低聚體狀態發生改變,從而使sHSP的生物學功能得以發揮[18]。目前研究最多的sHSP有HSP47和HSP27。 HSP47是內質網內唯一的一種熱休克蛋白,它是一種能與多種類型膠原和前膠原特異性結合的內質網駐留蛋白。在膠原合成及纖維化病理過程中發揮重要作用。國外有多項研究證實,抑制HSP47的表達,可抑制膠原合成,減弱纖維化程度[19-20]。HSP27為ATP非依賴性分子伴侶,其功能主要是防止蛋白質聚集. HSP27既可以維持細胞氧化還原穩態又可以維持線粒體的穩定性,結合和穩定肌動蛋白維持肌動蛋白網狀系統的完整性,防止凋亡因子如激活的Bid進入線粒體膜。
HSPs與針灸、中藥。HSPs對機體具有保護作用,故設法尋找一種沒有毒副反應的HSPs誘導劑或方法,誘導HSPs合成,增加機體對細胞的保護過程,已成為國內外研究的活躍領域。中醫中的針灸和中藥能影響HSPs的表達。在機體受到疾病損傷時,用對機體沒有損傷的針灸和中藥誘導HSPs的表達,對機體產生保護作用。
祖國醫學認為針刺作為一種刺激,作用于腧穴,通過經絡系統的傳導,調節機體臟腑功能,具有溫通經絡,消瘀散結,祛散陰寒,益氣升陷,回陽救逆及保健強身,預防疾病等作用,已得到國內外醫學界的公認[21]。臨床上,刺血療法治療類風濕性關節炎具有鎮痛和瀉熱作用顯著的特點,用三棱針在大鼠患側“昆侖”穴刺血,這種物理性刺激可以直接刺激機體促進HSP70的產生,增強HSP70表達。HSP70的增高又抑制炎癥細胞因子如IL-1、PGE2的轉錄,使之減少分泌并降低循環中的含量[22]。對心臟手術者取雙側內關、列缺、云門穴位針刺,發現針刺對心肌細胞HSPmRNA基因表達有一定的增強作用,表明針刺對心臟手術者的心肌缺血有一定保護作用。劉志彬等對慢性脊髓損傷大鼠模型使用電針治療后,通過增加HSP70的表達能量顯著降低iNOS的活性,保護脊髓神細胞并減輕繼發性脊髓損傷[23]。
艾灸是將艾葉點燃后放置在腧穴或病變部位進行燒灼和熏熨,借其溫熱刺激及藥物作用以防治疾病的一種外治方法。艾灸具有鎮痛、改善血循環、調整代謝紊亂、調節免疫功能和調整臟腑功能等作用。《醫學入門》說:“虛者灸之使火氣以助元氣也,實者灸之使實部隨火氣發散也,寒者灸之使其氣復溫也,熱者灸之引郁熱外發”。易受鄉等[24-26]對應激性胃潰瘍大鼠艾灸“足三里”“梁門”穴。研究結果顯示,與艾灸非穴對照點組比較,艾灸足三里、梁門穴組大鼠胃黏膜的HSP70家族的表達均明顯增強、MDA含量明顯減少胃黏膜損傷程度明顯減輕,顯著降低了應激性潰瘍指數和潰瘍面積比,并使應激模型大鼠的死亡率降低。
中藥復方或單味藥物的提取物能提高HSPs在機體的表達。于澤等[27]用三七五參湯作用與心肌缺血損傷的試驗中,Western和免疫組化結果顯示三七五參湯組大鼠心肌組織中HSP70的表達較正常組和模型組明顯為高,心肌損傷程度明顯減輕,說明三七五參湯對缺血心肌的保護作用可能與其誘發HSP70表達有關。涂勝豪等[28]觀察雷公藤甲素對膠原誘導的關節炎大鼠的作用。結果發現,雷公藤甲素可以有效地下調模型大鼠關節滑膜和軟骨細胞異常表達的HSP60、HSP70和MHC-Ⅰ類分子。在腦缺血再灌注中,分別用補陽還五湯、黃芪、川芎嗪、葛根素、丹參、復方阿魏酸來誘導HSP70,結果顯示,雖然這些藥物的作用機理不同,但是都使HSP70mRNA及蛋白表達明顯增強,對腦缺血損傷有保護作用。補陽還五湯可明顯抑制HSP70的轉錄,而黃芪則除了可明顯抑制其轉錄外,還可輕度降低HSP70的翻譯[29]。
參考文獻
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[關鍵詞]熱休克蛋白90(HSP90);糖尿病;難愈創面;創面愈合
[中圖分類號]R622 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)05-0691-04
Heat shock protein 90 promotes wound healing in the diabetic rats
REN Jing,ZENG Hai-feng,XIA Wei,LIU Bei,LI Yong
(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army,Xijing Hospitol,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China)
Abstract:ObjectiveHeat shock protein 90 (HSP90) could promote human epidermal cell migration in hypoxia which is the essential processes for skin wound healing. These processes are often disrupted in diabetic chronic wounds, causing patients morbidity and fatality. So we want to find out whether HSP90 could promote the epidermal cell migeration in the diabetic wound. Methods A d=2cm-sized stented wound were created in 80 streptozotocin-induced rats. A total of 100 diabetic wounds were studied in 5 groups (n = 20). The group B is blank Vaseline, the group C is 1μg/ml HSP90 plus Vaseline, the group D is 30μg/ml insulin plus Vaseline, the group E is 1μg/ml HSP90 and 30ug/ml insulin plus Vaseline. And we set group A as control group that is normal rats without treatment. We rubbed these kinds of Vaseline into the diabetic rat's wounds for 2 days. We used a group of normal rats without therapy as controls. The state of the wound healing was observed, and the percent of wound healing determined by measuring its size and by performing a histopathologic study. The statistical analyses were performed by t-test, using SPSS 14.0 software. On the 3th, 5th,7th, 10th, 14th and 21th, we tested the wound tissues by immunohistochemical staining and calculated integrated optical density (IOD) and density mean(DM)by image pro plus 6.0 software. Results On the 21th day, the wound closure rates of the group C(85.9%),D (86.8%)and E(96.8%) is significantly higher than group B(79.7%) (P
Key words: heat shock protein90(HSP90);diabetic wound;wound healing;diabetes
糖尿病造成的難愈創面已成為目前臨床治療的一大難題,研究表明,高糖會抑制人表皮細胞的遷移,從而導致創面上皮化延遲[1-2]。近來,Li.W的研究發現熱休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)能夠有效促進人表皮細胞的遷移[3],而關于其是否能夠有效促進糖尿病性難愈創面的研究并未見報道。本實驗旨在將HSP90應用于糖尿病性難愈創面,并輔以胰島素作為參照,以觀察不同時期各組創面的愈合程度及創面中HSP90的表達含量。
1材料和方法
1.1動物及分組:選用健康清潔級雄性SD大鼠100只,由第四軍醫大學動物試驗中心提供,體重(200±3)g,分為A、B、C、D、E五組,每組20只。A組為正常創面但不予以任何治療,即對照組;B組為糖尿病大鼠難愈創面給予空白凡士林藥膏治療組,即空白組;C組為糖尿病大鼠難愈創面給予含有HSP90的凡士林藥膏治療組,即HSP90組(HSP90濃度:1μg/ml);D組為糖尿病大鼠難愈創面給予含有胰島素的凡士林藥膏治療組(胰島素濃度:30μg/ml)E組為糖尿病大鼠難愈創面給予含有HSP90及胰島素的凡士林藥膏治療組,即聯合用藥組(E組,HSP90濃度:1μg/ml,胰島素濃度:30μg/ml)。每組n=(5n1+n2)=20只,共100只大鼠,
1.1.1 構建2型糖尿病難愈創面模型:采用鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)法誘導2型糖尿病造模。各組提前4周高脂高糖飲食,饑餓12h后以40mg/kg腹腔注射STZ并維持高脂高糖飲食,并于注射后48h用強生穩步血糖儀檢測空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),FBG值>16.7mmol/L,體重明顯下降(>50g)為造模成功[4]。三天后補注STZ(以10～20mg/kg體重劑量腹腔注射),并測量FBG值。切取全層皮膚暴露肉膜為準后以d=2cm的金屬環間斷縫合固定于創緣,防止創面攣縮。
1.1.2 給藥及分組:A組不涂抹任何藥物;B組為空白藥膏;C組為含有濃度1μg/ml HSP90的藥膏;D組為含有濃度30μg/ml胰島素的藥膏;E組為含有1μg/ml HSP90及30μg/ml胰島素的藥膏。各給藥組均以外用涂抹局部給藥,藥膏均勻覆蓋整個創面(約1g/次)為準(含有藥物的藥膏均委托金花生物制藥集團有限公司完成)。HSP90的濃度為我們參考了Li.W試驗中用于正常創面的治療濃度后[3],并以15只糖尿病大鼠給予1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml進行了簡單的預實驗,發現三種濃度的效果并無顯著差異,所以取最小濃度。
6941,
2實驗過程及觀察設計
在創面形成后即時給予難愈創面藥物治療持續2天,A組則不治療,動物創面予以暴露。創面的固定環會于創面形成后的第10天予以摘除,因為此時皮膚攣縮力量較大,會導致縫合線斷裂,為統一標準予以摘除。并創面形成后第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天進行大體觀察及活體取材做常規病理學觀察,在第3天、第5天、第7天、第10天及第14天5個時間點各取n1=3個標本,而在第21天取n2=5個標本,各標本取材時取全層厚皮膚,保留創緣約1～2mm的正常皮膚。
2.1 大體觀察指標:分別于用藥后第3、5、7、10、14、21 進行大體拍照觀察并采用ADOBE photoshop cs4 計算各時期的創面愈合率;
2.2 鏡下觀察指標:并于3、5、7、10、14、21天取創面標本,3、5、7、10、14天每組各時間點3只,21天時每組5只。皮膚標本剪成橫斷面,標本均用1%中爾馬林固定,石蠟包埋,連續切片,分別進行HE染色、并使用ABC法進行HSP90的免疫組化染色。并采用image pro plus 6.0彩色圖像分析系統, 每張切片選取5個有代表性的200倍視野,測量每個標本HSP90陽性表達密度及積分光密度IOD值的均值并記錄。
2.3 數據統計:所得試驗數據均采用SPSS11。文中數據以均數和標準差(x±s) 表示,并且對創面愈合率采用兩個獨立樣本t檢驗進行比較。
3實驗結果
3.1 大鼠創面愈合率差異比較:各組大鼠在各時間點創面愈合率比較見表1。由表可見,單獨使用HSP90(C組)及單獨使用胰島素(D組)均能夠提高創面的愈合率(與同期B組相比,P
3.2 各組創面第10天時HSP90的免疫組化對比:見圖1～5。由圖可見,聯合用藥組及正常創面對照組創面中,HSP90的陽性表達較為強烈。
3.3 HSP90陽性表達的比較:為更加客觀的反應HSP90在創面中的陽性表達狀況我們選取平均陽性率及積分光密度作為指標[5-6]。各組大鼠各時間點HSP90平均陽性率(Density Mean,DM)值的比較見圖6。各組大鼠各時間點創面中HSP90的平均積分光密度(Identical Optical density,IOD)的比較見圖7。
由圖6、圖7我們發現:①在糖尿病大鼠創面中,HSP90的表達明顯下調(同期對照組相比,P
4討論
美國創面愈合協會的資料顯示大約有66%的難愈性創面即使經過6個月的治療護理仍無法治愈[7],僅處理創面的材料每年就花費90億美元[8]。糖尿病創面的治療一直是難題,表皮細胞遷移遲緩也是其發生機制的一個重要特點。 在糖尿病創面的臨床治療中,胰島素的局部應用的療效及作用機制均得到了驗證,這一方法也成為了臨床治療糖尿病創面的經典方法。而其作用機制主要在于降低創面組織血糖濃度,加快糖尿病創面的新生毛細血管形成,促進上皮細胞的增殖與遷移[9-10]。
2007年DR. Woodley等發現人表皮細胞受到缺氧刺激后,會大量分泌HSP90α,在胞外的HSP90α能夠有效促進人表皮細胞的遷移,并將其應用于正常創面,發現HSP90α能夠加速創面的再上皮化過程[3,11]。在此之前,人們對于HSP90的關注了解更多的集中在癌癥領域,作為重要的分子伴侶,它介導了多條調控細胞增殖、凋亡、遷移的信號通路[12],并保護細胞產生應激反應,抵抗各類損傷帶給機體的不可逆性傷害[13]
在本實驗中我們主要為了研究HSP90是否能夠促進糖尿病性難愈創面的愈合,并觀察HSP90在糖尿病性難愈創面中的表達,探索HSP90在創面中的表達是否與創面的愈合速率有關聯。我們的研究發現:在大體觀察下,①外源性給予糖尿病性難愈創面HSP90,同期的創面愈合率有所提高(與同期空白組相比,P0.05)。僅從大體實驗的觀察結果我們認為,創面中HSP90的表達與糖尿病難愈創面的愈合是存在相關性的。在鏡下觀察,我們發現:①糖尿病性難愈創面的高糖微環境明顯抑制了HSP90的表達(空白組與同期對照組相比,P
分析結果我們認為,高糖環境會降低HSP90在創面中的表達,減弱HSP90對細胞的保護作用。并且創面中HSP90的表達高低與創面的愈合速率具有相關性。雖然無論是局部給予胰島素改善高糖微環境,還是局部應用HSP90提高創面中HSP90的表達,均能夠提高糖尿病性難愈創面的愈合率,但是我們發現聯合應用后糖尿病性難愈創面的愈合效果最好。據此我們認為,胰島素改善了糖尿病性難愈創面的局部微環境,有利于創面中HSP90的表達提高,進一步局部給予HSP90,提高創面中HSP90的含量,從而激活部分HSP90參與調控的信號通路,提高創面中各類生長因子的表達,促進了糖尿病性難愈創面的愈合。
然而,我們的研究尚屬淺顯,對于HSP90在糖尿病創面愈合過程中的作用機制也未進行研究。但是,依然為我們尋找糖尿病創面的治療方向提供了一個具有臨床應用意義的思路。下一步,我們會對HSP90在糖尿病性難愈創面的作用機制進行進一步的研究,探索HSP90在糖尿病性難愈創面中所調控的與創面愈合密切相關的生長因子與細胞外基質的變化。并且HSP90的提取目前還很昂貴,所以進一步尋找到其穩定的上游信號分子或尋找一種能夠有效且廉價的提取HSP90的方法會成為我們今后的研究方向。
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【關鍵詞】 子宮內膜
關鍵詞: 子宮內膜;熱休克蛋白;免疫組織化學;圖像分析
摘 要:目的 探討不同子宮內膜中熱休克蛋白（HSP）70和90表達與ER表達的關系. 方法 用免疫組化Envision法和圖像分析儀檢測了30例正常子宮內膜、30例增生過長子宮內膜和53例子宮內膜癌中HSP70、HSP90和雌激素受體（ER）的表達. 結果 增生期內膜中HSP90和ER的表達（62.1±6.0）%和（67.80±4.2）%，明顯強于分泌期內膜（42.0±5.2）%和（40.2±7.8）%，P
Keywords:endometrial carcinoma;heat shock protein;im-munohistochemistry;imaging analysis system
Abstract:AIM To investigate the expression of heat shock protein70，90in different endometrium and the correlation between HSP70，90and ER status.METHODS Thirty sam-ples of normal endometrium，30samples of endometrial hy-perplasia and53samples of endometrial carcinoma taken from Xijing Hospital were examined for HSP70，90and ER expres-sion by using Envision immunohistochemical analysis and computerized imaging analysis system.RESULTS Expres-sion of HSP90and ER in proliferative phase（62.1±6.0）%，and（67.8±4.2）%is stronger than in secretory phase of normal endometrium（42.0±5.3）%and（40.2±7.8）%，P
0 引言
子宮內膜增生過長和子宮內膜癌常見，但其分子病理學改變卻知之甚少.熱休克蛋白（HSP）是一組高度保守的伴侶蛋白，HSP70，HSP90在人類子宮內膜中均有表達，受甾體激素調節，與甾體激素受體如雌激素受體（ER）及孕激素受體（PR）表達有關.我們采用免疫組化法和圖像分析法探討不同子宮內膜中HSP70，90表達與ER表達的關系.
1 材料和方法
1.1 材料 1999-01/2001-12西京醫院病理科子宮切除和內膜刮除正常內膜30例（增生、分泌期各15例），增生過長內膜30例（簡單型20例，復雜型10例），子宮內膜樣癌53例（病理分級:Ⅰ級30例，Ⅱ級14例，Ⅲ級9例;組織學類型:內膜樣腺癌39例，非內膜樣腺癌14例;臨床分期:Ⅰ/Ⅱ期42例，Ⅲ/Ⅳ期11例），所有標本診斷均經組織病理學證實.標本蠟塊，連續切片，厚5μm.兔抗人HSP70，HSP90多克隆抗體為美國Maxin Biotech Inc產品，小鼠抗人ER單克隆抗體為美國Antibody Diagnostica Inc產品，山羊抗兔Envision二抗為美國Dako公司產品.
1.2 方法 石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇致水，磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS，pH=7.2）沖洗.微波爐0.01mol?L-1 枸櫞酸鈉緩沖液（pH=6.0）行抗原修復（5min×2次），自然冷卻.30g?L-1 過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，室溫，30min.正常山羊血清封閉非特異性抗原，室溫，10min，濾紙吸去封閉血清.兔抗人HSP70，90抗體，小鼠抗人ER抗體，37℃，120min.山羊抗兔Envision二抗，37℃，30min，DAB顯色，蘇木精復染、脫水、透明、樹膠封片.陽性對照采用已知陽性結果的肝癌切片，陰性對照用PBS代替一抗.用Leica Q500Mc圖像分析儀測陽性結果的相對染色強度，每張片子選5個高倍視野（×200），以顏色為標準作圖像分割，測陽性結果的相對不透光度（%）.結果用SPSS統計軟件處理.
2 結果
2.1 子宮內膜HSP，ER的表達 HSPs陽性信號為上皮和基質細胞的胞質和/或胞核內出現棕黃色顆粒，ER陽性信號為上皮和/或基質細胞的胞核內出現棕黃色顆粒，陽性細胞呈局灶性或彌漫性分布（Fig1）.增生期內膜中HSP90，ER表達（62.1±6.0）%和（67.80±4.2）%，明顯強于分泌期內膜（42.0±5.2）%和（40.2±7.8）%，P
2.2 子宮內膜癌中HSPs表達與臨床病理學指標的關系 內膜癌中HSP70表達隨病理分級升高而表達增強（48.2±5.0）%，（62.7±4.3）%和（75.2±2.8）%，P
3 討論
HSPs是一組具有重要生理功能高度保守的糖蛋白超基因家族，生理、病理及環境因素均可誘導HSPs的產生，對細胞的生存起保護作用［1-4］ .研究表明，HSPs與細胞的增生、分化、瘤變及凋亡等生長過程有關［5-9］ .有關子宮內膜中HSPs與ER表達關系的研究國內外報道不多.有報道指出:HSP90可促進子宮內膜上皮細胞增生，子宮內膜癌中HSP70，90表達與內膜癌組織學類型和性激素受體表達顯著相關［10］ .我們的研究表明，HSP70，90在增生期、分泌期子宮內膜中都有表達，增生期子宮內膜中HSP90表達強于分泌期內膜，增生過長內膜中表達進一步增強，分泌期內膜中HSP70表達強于增生期內膜.說明HSP70，90在子宮內膜的增生分泌中均起一定作用，HSP90可能促進子宮內膜增生，HSP70主要與子宮內膜的分泌活動有關.
圖1 略
內膜癌中HSP70，90表達有明顯變化，內膜癌中HSP90表達較正常內膜和增生過長內膜減弱，HSP70表達反而增強，說明HSP70可能對內膜癌變有促進作用，而HSP90對內膜癌變有一定的保護作用.內膜癌中HSP90隨腫瘤分級升高而減弱，HSP70隨腫瘤分級升高而增強，內膜樣癌中HSP70表達較非內膜樣癌中弱，而HSP90較非內膜樣癌強.腫瘤細胞分級及組織學類型和患者的預后是密切相關的:子宮內膜癌患者5a存活率隨腫瘤細胞分級升高而明顯降低，腺鱗癌、透亮細胞癌和漿液性狀腺癌等較內膜樣癌預后差［11］ ，說明預后差的腫瘤中HSP70表達強，HSP90表達弱.預后差的腫瘤細胞生長速度快而凋亡少，細胞分化程度低，說明HSP70過表達對癌細胞分化和凋亡有抑制作用，HSP90作用可能相反.113例子宮內膜HSP70，90與ER表達的相關性分析表明，HSP90表達與ER表達成正相關，HSP70表達與ER表達成負相關.子宮內膜增生過長和內膜癌的發生及內分泌治療效果與雌激素作用和ER表達有關.故研究子宮內膜中HSPs表達對探討內膜生長規律及病變機制、改善治療措施及治療效果等方面將有很大的指導意義.
圖2 － 圖4 略
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[主題詞] 電針;心臟外科手術;熱休克蛋白質類/代謝;RNA,信使/代謝
Effects of Electroacupuncture on Myocardial Cellular HSP70mRNA Gene Expression in Patients Undergoing Cardiac Surgery
Wang Xiangrui1,Zhang Tengfei2,Ma Shuliang1,et al(1. Renji Hospital Affiliated to Shanghai Second Medical University,Shanghai 200127;2. Teaching and Research Section of Biochemistry,Shanghai Second Medical University)
[Abstract] Purpose To observe the effect of electroacupuncture on myocardial cellular HSP70mRNA gene expression in patients undergoing cardiac surgery(ASD).Methods 28 ASD patients were randomly divided into 3 groups,i,e,acupuncture anesthesia group(groupⅠ,n=6),acupuncture combined with general anesthesia group(group Ⅱ,n=10) and general anesthesia group(groupⅢ,n=9).The sample from left atrium at 10 min before CPB,stopping CPB,30 min and 1 h after stopping CPB.Extration of total RNA from myocardial tissue using Reagent Kit.The concentration of mRNA was measured through RTPCR and CKMB was detected.Results After CPB CKMB in the three groups was significantly higher than the value of 10 min before CPB,and CKMB in the group Ⅲ was remarkedly higher than the group Ⅰ and Ⅱ;HSP70mRNA expression was found to be higher in the group Ⅰ than that of group Ⅲ at 30 min and 1 h after stopping CPB.Conclusion Electroacupuncture can induce the expression of HSP70mRNA in ischemic myocardial tissue of patients undergoing cardiac surgery.
[Key words] Electroacupuncture;Heart Surgery;RNA,Massenger/metab;HeatShock Proteins/metab;Myocardium/metab
體外循環心臟手術術后并發癥的發生率與術中心肌缺血、缺氧的保護有明顯關系[1]。除采用低溫、不同成份灌注液的冠脈灌注等方法外,近年發現機體有自身的保護機制,心肌缺血、缺氧后誘導心肌內應激蛋白增加,從而增強機體抗御缺血的能力。筆者發現針刺麻醉病人術后恢復快,并發癥少。為探討針刺對心臟功能的調節作用[2],本文觀察針刺對心臟手術病人心肌細胞熱休克蛋白mRNA基因表達的影響,初步分析兩者之間的相互關系。
1 資料和方法
1.1 一般資料
隨機選擇房間隔缺損修補術(ASD)28例,分針麻組(組 Ⅰ)6例,男 女各3例,年齡26.0±5.3歲;針刺加全麻組(組 Ⅱ)10例,男4例,女6例,年齡27.1±7.4 歲;全麻組(組 Ⅲ)9例,男5例,女4例,年齡26.8±5.4歲。各組病人術前心功能 Ⅰ ～Ⅱ級。
1.2 麻醉方法
針刺穴位取雙側內關、列缺、云門,進針后接G 6805針麻刺激儀,脈沖頻率為3～4 Hz,電流量以病人舒適為度,誘導時間20～30 min,體外循環肝素化時,留針停止刺激,待魚精蛋白中和肝素后恢復刺激。
全麻組病人術前用藥為肌注苯巴比妥鈉0.1 g,哌替啶50 mg,東莨菪堿0.3 mg,麻醉誘導安定0.1 mg/kg,維庫溴銨0.25 mg/kg,依托咪酯0.2 mg/kg,芬太尼5 μg/kg,麻醉維持吸入異氟醚,間斷靜注芬太尼和維庫溴銨。
1.3 標本采集
上腔靜脈插管前(轉流前10 min),停心肺轉流機和停機后30 min,1 h分別自右心耳剪下1 mm×1 mm×1 mm標本。體外循環機最大轉速4 L/min,最低溫度針麻組26.02±0.12 ℃,針刺加全麻組23.41±1.52 ℃,全麻組 22.92±1.65 ℃。
1.4 HSP70mRNA的分離提取
應用Reagent抽取組織總RNA,通過勻漿化、分離、洗滌、溶解、沉淀分離總RNA,紫外分光光度儀測定RNA濃度,加入隨機引物和探針,經RTPCR擴增后,溴芬蘭染色在0.8%膠走電泳,以123 Mark標記分子量。顯色后斑點雜交膜用密度掃描儀(島津CS920型)對HSP70mRNA進行定量。
1.5 心肌酶譜CKMB測定
自右頸內靜脈導管抽取近右心房處血標本,采用日立7150全自動分析儀測定肌酸磷酸激酶同功酶(CKMB)。
1.6 術后并發癥發生率
術后低血壓、循環功能不穩定者所應用血管活性藥物發生率和每人平均用量;神經系統并發癥,包括腦栓塞、腦出血、意識功能障礙;腎功能不全監測、少尿、無尿及術中知曉發生率。
1.7 統計學處理
各時點數據用均數±標準差表示。各數值輸入SAS軟件進行統計學處理。組內各數據采用配對t檢驗,組間各數據采用方差分析。
2 結果
2.1 3組病人體外循環轉流前后CKMB的變化
3組病人停轉流和轉流后1 h CKMB均較轉流前明顯增高(P
2.2 3組HSP70mRNA含量的比較
通過斑點切跡雜交顯色,可見針刺組HSP70mRNA表達高于對照組,斑點切跡經薄層掃描儀定量,其密度值見表2。
2.3 CKMB與HSP70mRNA含量之間的關系
停轉流1 h時,組ⅠHSP70mRNA增高39.7%, CKMB增高272.7%,組ⅢHSP70mRNA增高10.3%,CKMB增高696.6%,HSP70mRNA基因表達率增加與CKMB增加的幅度相關,HSP70mRNA明顯增加,CKMB的增幅明顯下降。
2.4 術后并發癥發生率
組Ⅲ術后1天循環功能不穩定需用血管活性藥物5例,占總數31.0%;神經意識障礙、腦栓塞2例,占14.4%;平均術后恢復天數5.41±0.82天,均明顯高于組Ⅰ和組Ⅱ(P
3 討論
當機體受到應激因子刺激,組織細胞可產生應激蛋白,對機體產生自身保護作用,熱休克蛋白屬一類應激蛋白,包括HSP90,HSP70,HSP60和HSP27等類型,參與組織蛋白質折疊和復合物的形成[3]。
近年對HSP70的研究較為詳細,HSP70家族至少包括4種同分異構體,HSP75,78為葡萄糖調節蛋白,前者存在于線粒體,后者存在于肌漿網,HSP為存在于胞漿中的非應激蛋白,HSP72在非應激狀態下不存在于細胞中,而在各種引起細胞蛋白損傷因素(缺血、熱、缺氧、代謝抑制、乙醇、蛋白變性等)存在時迅速合成。減輕心肌缺血再灌注損傷,提高缺血后心臟的機械功能,有利于ATP的保存和保護線粒體功能[4],心功能的恢復與HSPmRNA表達和HSP70的含量有關[5]。
心肌缺血再灌注損傷的主要原因之一是氧自由基產生,損傷細胞膜,破壞細胞核和核糖蛋白,抑制細胞酶系統,影響細胞功能[6,7]。熱休克蛋白能減少氧自由基釋放,穩定細胞膜和溶酶體膜,防止蛋白質變性,減輕心肌的缺血再灌注損傷。
本研究結果表明針麻組和針刺加全麻組停心肺轉流和停轉流后1 h HSP70mRNA基因和HSP70含量高于單純全麻組病人。因而針刺對心肌細胞熱休克蛋白mRNA基因表達有一定的增強作用。分析3組病例熱休克蛋白mRNA基因表達與反映心肌缺血酶指標之間的關系可見,針刺組和針刺加全麻組,轉流后熱休克蛋白mRNA表達高于全麻組,而CKMB指標的增高幅度則小于全麻組,表明針刺對心臟手術病人的心肌缺血有一定保護作用。其中增強術中熱休克蛋白的基因表達,減少氧自由基生成可能是針刺增加心肌對缺血心肌的保護作用機制之一。在心臟外科領域,如能通過不同方法誘導心肌HSP70mRNA的表達,對于減輕心肌的缺血再灌注損傷,改善心臟手術的預后具有一定的臨床意義。
術后并發癥的統計表明,全麻組術后2天以內,由于循環功能不穩定者需用血管活性藥物占31.0%,精神神經系統并發癥占14.4%,全麻輔助針刺和針麻病人術后均未應用血管活性藥物,未見神經系統并發癥。雖然針麻體外循環病人轉流中最低溫度較其它兩組要高,但術中心臟全部自動復跳,明顯高于全麻組病人,表明針刺有助于減輕全麻藥對循環系統的抑制作用,通過內在的調節機制增強心肌對缺血缺氧的耐受性。
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【關鍵詞】 心肌間質
Effects of heat shock protein 70 on immature myocardium and myocardial interstitium in rabbits
【Abstract】 AIM: To investigate the protective effects of heat shock protein 70 (HSP70) on immature myocardium and myocardial interstitium. METHODS: Isolated working rabbit heart model was used in this study. Twelve rabbits (aged 14-21 days) were randomly pided into 2 groups: Control group (C) undergoing 45 min ischemia followed by 45 min reperfusion after distilled water was injected by intraperitoneum 24 h later， and experimental group (E) undergoing 45 min ischemia followed by 45 min reperfusion after norepinephrine was injected by intraperitoneum 24 h later. The HSP70 content， lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK) leakage， adenosine triphosphate (ATP) and malondialdehyde (MDA) content， superoxide dismutase (SOD) activity， hydroxyproline (HP) and endothelin (ET) content， myocardial cell Ca2+ content， Ca2+ATPase activity of mitothondia (［Ca2+ATPase］m) and its Ca2+ content (［Ca2+］m)， synthesizing ATP activity of mitochondria(［ATP］m) and myocardial ultrastructure were tested. RESULTS: The cardiac function recovery was better in E group than C group (P
【Keywords】 heat shock protein 70; immature myocardium; myocardial interstitium; cardioprotection
【摘要】 目的: 探討熱休克蛋白70(HSP70)對未成熟心肌和心肌間質的影響. 方法：健康新生長耳大白兔12只隨機分為2組. 對照組(C組)：ip生理鹽水0.4 mL，24 h后取離體心臟，常規建立Langendorff離體心臟灌注模型，灌注15 min轉為工作心15 min后停灌45 min，恢復灌注15 min改為工作心30 min；實驗組(E組)：ip去甲腎上腺素， 24 h后取離體心臟，方法同對照組. 測定心肌細胞中HSP70含量、血流動力學指標、心肌含水量（MWC）、心肌肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）漏出率、三磷酸腺苷(ATP)含量、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛(MDA)含量、心肌組織羥脯氨酸（HP）含量、內皮素(ET) 含量、心肌細胞內Ca2+含量、心肌線粒體Ca2+ATPase活性及其Ca2+含量、心肌線粒體合成ATP能力［ATP］m，心肌超微結構. 結果：E組HSP70含量明顯高于C組(P
【關鍵詞】 熱休克蛋白70;未成熟心肌;心肌間質;心肌保護
0引言
1988年Currie等［1］證實在某些非致死性應激（如高溫，缺血再灌注）條件下能誘導合成熱休克蛋白（heat shock proteins， HSP）能提高對應激的耐受力，其中HSP70家族倍受重視. 在成熟心肌中，人們通過各種方式能誘導HSP70表達增強了心肌的抗損傷能力. 然而在未成熟中，人們對心肌HSP70表達及抗損傷能力并不清楚. 我們觀察ip重酒石酸去甲腎上腺素誘導HSP70在未成熟心肌中的表達對缺血再灌注時心肌的影響.
1材料和方法
1.1材料
出生14~21 d的健康新生長耳大白兔12只，隨機等分為2組：實驗組(E組)和對照組（C組）. 對照組ip生理鹽水0.4 mL后24 h取離體心臟，常規建立Langendorff模型，灌注15 min轉為工作心15 min后停灌45 min，恢復灌注15 min改為工作心30 min；實驗組，重酒石酸去甲腎上腺素(溶于生理鹽水中)3.1 μmol/kg (0.53 mg/kg) ip后24 h取離體心臟，方法同對照組.
1.2方法
兔心臟跳動穩定后，記錄心率(heart rate， HR)、主動脈流量(aortic flow， AF)、冠狀動脈流量(coronary flow， CF)、心排出量(cardiac output， CO)、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure， LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular enddiastolic pressure， LVEDP)、左心室內壓上升最大速率(+dp/dtmax)、左心室內壓下降最大速率(-dp/dtmax)等，以持續停灌前工作心基礎水平為100%，比較復灌末心功能恢復的百分率. 實驗結束后取標本測心肌含水量(myocardial water content， MWC)、心肌肌酸激酶(creatine kinase， CK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH) 15 min漏出率、心肌組織三磷酸腺苷（ATP）含量(熒光素酶法)、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛(MDA)含量 (化學比色法，試劑盒購自南京聚力生物工程研究所)、心肌組織羥脯氨酸（hydroxyproline， HP）含量、內皮素(endothelin， ET) 含量、心肌線粒體Ca2+ATPase活性及其Ca2+含量、心肌線粒體合成ATP能力［ATP］m、心肌超微結構等. 采用Western blot法測定心肌細胞中HSP70含量. 用2×SDS樣品緩沖液裂解細胞，收集細胞蛋白質，經SDSPAGE分離后迅速轉移至尼龍膜，按文獻［2］加入抗HSP70 mAb（1∶1000）及堿性磷酸酶偶聯的抗小鼠IgG（1∶1000），用硝基藍四氮唑/溴氯吲哚磷酸鹽（NBT/BCIP）顯色.
統計學處理：所有數據以x±s表示，采用t檢驗. P
2結果
2.1血流動力學指標E組與C組比較，HR，AF恢復率差異無顯著性，CF，CO，LVSP，LVEDP，+dp/dtmax和-dp/dtmax差異有顯著性(P
2.2生化指標E組MWC低于C組(P
表4心肌線粒體Ca2+ATPase活性、Ca2+含量及合成ATP能力（略）
轉貼于
2.3心肌超微結構C組：線粒體腫脹明顯，部分呈空泡狀融合并溢出細胞外，線粒體嵴溶解明顯；肌絲排列紊亂、溶解(Fig 2A). E組：線粒體輕度腫脹，偶有線粒體呈空泡狀，線粒體嵴排列尚整齊、密度無增高；肌絲排列整齊(Fig 2B).
3討論
HSPs有多個家族，其中HSP70家族（Mr 66 000~78 000）是最豐富的HSPs，HSP70家族是一類最保守和最重要的熱休克蛋白家族，在心肌保護中起重要作用. HSP70參與蛋白質的折疊和伸展、多聚復合物的裝配以及蛋白質在胞質與細胞器之間的移位等. 已有實驗證實HSP70誘導總量（或表達）與心肌缺血、壞死的范圍及程度呈負相關［3］. HSP70具有幫助蛋白質完成細胞內轉移的功能(分子伴侶功能)［4］. 在應激狀態下HSP穩定細胞內變性的蛋白質，有利于它們的消除和修復，從而在應激狀態下起到保護和恢復細胞功能的作用，其解離過程需要ATP參與. HSP70也是一種類固醇激素受體結合蛋白［5］，類固醇激素受體可以與HSP70結合，結合后HSP70將此受體由胞質運送到細胞核中，發揮受體的作用.
在心肌組織，熱休克處理后，無論成熟的或未成熟的心肌細胞都能合成HSP70 ［6］. 許多應激原如缺血、缺氧、壓力或容量負荷、重金屬、藥物［7］等和熱應激一樣，在心肌細胞中都能誘導HSP70表達，對抗缺血后再灌注損傷. 在冠狀動脈內皮細胞同樣也可以誘導HSP70的表達［8］，發揮心肌抗缺血后再灌注損傷作用. 研究證實，5′核苷酸酶活性增強在心肌HSP70抗缺血后再灌注損傷中起重要作用［9］，經過熱預處理或缺血預處理的心肌同樣表達HSP70，與缺血預處理一樣具有心肌保護作用［10］. 近來研究表明，HSP70的表達與蛋白激酶C(protein kinase C， PKC)激活密切有關［11］，心肌保護作用與HSP70減少線粒體損傷相關［12］. 我們的實驗通過ip重酒石酸去甲腎上腺素誘導心肌HSP70表達. 結果顯示，ip 24 h后HSP70蛋白表達明顯增多. 離體心臟實驗結果表明，與C組比較，E組在再灌注期間，左室的舒縮功能明顯改善，LDH， CK和ET的漏出率及MDA含量減少，心肌水腫減輕，ATP， HP含量及SOD活性增高，E組心肌細胞內、線粒體內Ca2+明顯含量減少，線粒體ATP合成能力和心肌線粒體Ca2+ATPase活性較C組明顯增加，心肌超微結構損傷明顯輕于C組，證實HSP70的表達對缺血再灌注未成熟心肌功能和形態具有明顯的保護效應.
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方法 搜集2013年7月至2015年8月經病理證實為HCC的患者62例，所有病例術前行CT平掃及3期增強掃描，通過對比患者術前CT表現與術后癌組織GPC-3，HSP70的表達水平、病理分級，統計分析其是否存在相關關系。
結果 本研究62例HCC患者中肝癌的大小、動脈期血管強化及肝癌的供血類型與GPC-3表達水平存在相關性，不同供血類型的肝癌HSP70的表達水平存在差異；肝癌的大小、邊緣、瘤內出血壞死與其病理分化程度相關；肝癌的病理分化程度越低GPC-3及HSP70的表達水平越高。
結論 肝癌的CT征象可在一定程度上反映癌組織GPC-3及HSP70的表達情況及肝癌的病理分化程度，GPC-3和HSP70表達水平與肝癌的病理分級相關。
【關鍵詞】 肝細胞肝癌； 病理分級； 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3； 熱休克蛋白70
中圖分類號：R735.7 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.03.005
【Abstract】 Objective To investigate the correlation of preoperative CT findings between expressions and pathological grade of postoperative glypican-3（GPC-3） and heat shock proteins 70（HSP70） protein in hepatocellular carcinoma（HCC）.
Methods A total of 62 cases who were pathologically proved with HCC from July，2013 to August，2015 were enrolled in this study.All cases underwent CT plain scan and 3 phase enhanced scanning before operation.And by comparing preoperative CT findings and the expression levels of postoperative GPC-3，HSP70 and pathological grade，whether there was a correlation between them was counted and analyzed.
Results In this study，the size of liver cancer，arterial blood vessels and blood supply type of liver cancer were correlated with GPC-3 expression levels in 62 cases of HCC patients，and the expression level of HSP70 in HCC with different blood supply types was different.The size，margin，intratumoral hemorrhage and necrosis of HCC were correlated with the degree of pathological differentiation.In addition，the lower the degree of pathological differentiation，the higher the expression level of GPC-3 and HSP70.
Conclusion CT findings of HCC can reflect the expression of GPC-3，HSP70 and liver pathological differentiation in a certain extent，and the expression level of GPC-3 and HSP70 were correlated with HCC pathological grading.
【Key words】 HCC；pathological grade；GPC-3；HSP70
肝胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）在我國發病率較高，最新統計資料顯示，肝癌發病率位于肺癌和胃癌后排第三位，而其所致的男性惡性腫瘤死亡率僅次于肺癌[1]。CT是目前肝癌診斷的重要影像學方法，不僅可以觀察肝癌的形態、大小及其對周圍鄰近組織的關系，更能通過增強掃描的方法來觀察肝癌的血供狀況，對肝癌的檢出、定性、分期及治療后復查具有重要意義[2]。病理學檢查是診斷肝癌的金標準，而免疫組織化學是診斷肝癌的重要輔助手段。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 （Glypican-3， GPC-3）及熱休克蛋白70（Heat shock proteins 70， HSP70）是肝癌診斷的代表性免疫組織化學標志物之一，近些年來，多個研究結果都表明GPC-3及HSP70在肝癌的發生、發展中都扮演了重要的角色[3～5]。筆者擬通過研究HCC的CT表現與癌組織中GPC-3、HSP70表達及病理分級的關系，為肝癌的診斷、治療及預后評估提供更多信息。
1 資料與方法
1.1 一般資料
搜集右江民族醫學院附屬醫院2013年7月至2015年8月病理科確診為HCC的患者62例，其中男性52例，女性10例，年齡22～76歲，平均年齡49.74歲。所有病例術前行CT平掃及3期增強掃描，未接受放化療、腫瘤靶向治療等非手術治療，粒子植入、碘油栓塞等介入治療。術后用免疫組織化學法分析癌組織GPC-3及HSP70表達情況。本研究所有病例均有完整的隨訪資料。
1.2 CT檢查及征象判斷方法
CT檢查方法：采用GE Highspeed N x/I或西門子Definite AS 128層螺旋CT掃描儀。常規進行胃腸道準備，先平掃，增強掃描對比劑用優維顯（300 mgI/ml）80～100 ml，注射速率3～3.5 ml/s，注射對比劑后分別行動脈期（30 s）、門靜脈期（65 s）和平衡期掃描（120 s）。CT征象判斷方法：參照陸玉敏等[6]的標準對腫瘤直徑分為小肝癌組（≤3 cm）和大肝癌組（>3 cm）。腫瘤邊緣分為清楚和模糊兩組。根據腫瘤內是否有平掃低或高密度、增強或無強化改變分為有出血壞死和無出血壞死兩組。肝內或肝外侵襲轉移分為有侵襲轉移組和無侵襲轉移組。結合黃娟等人[7]的研究將其分為：肝動脈供血型、門靜脈供血型、肝動脈及門靜}雙重供血型和少血供型。
1.3 病理檢查及判斷方法
將所有62例標本常規石蠟包埋，連續切片，切片厚度3 μm，行S-P法免疫組織化學染色，鼠抗人GPC-3及HSP70抗體即用型，所用試劑盒購自北京中衫金橋生物技術有限公司，染色步驟按說明書進行。陽性結果的判讀：綜合考慮免疫組化染色強度和細胞染色陽性率，每張染色切片隨機選取 5 個染色均勻的高倍視野（×400），取平均數。判定標準：染色強度按無色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計為0分、1分、2分、3分；陽性細胞按無陽性細胞、陽性細胞比例≤25%、26%～50%、51%～75%、>75% 分別計為0分、1分、2分、3分、4分。染色強度與陽性細胞百分比的乘積3且≤6者（+），>6且≤9者（++），>9且≤12者（+++）。HCC的病理分級采用國際上常用的Edmondson-Steiner分級法：I級：癌細胞形態似正常肝細胞，核圓而規則，核仁明顯，核分裂象少，核漿比例接近正常；Ⅱ級：癌細胞略異型，胞質嗜酸性和顆粒性強，胞核較大，核著色深淺不一，核仁明顯，核漿比例接近正常或略增大；Ⅲ級：癌細胞異形明顯，胞質呈嗜堿性著色，核大而不規則，核染色質粗，著色不一致，核仁明顯，核分裂象多；Ⅳ級：癌細胞形態變異大，可呈梭形或多形性巨細胞或小細胞，核大，核仁不規則，核漿比例明顯增大。
1.4 統計學方法
應用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料組間比較用t檢驗，計數資料比較用卡方檢驗，等級資料比較用秩和檢驗，檢驗水準：α=0.05， 雙側檢驗。
2 結 果
2.1 肝癌CT表現及病理分級與GPC-3、HSP70表達的關系 本組62例HCC患者CT表現中，小肝癌組10例，大肝癌組52例；邊緣清楚者32例，邊緣模糊者（圖1A）30例；有壞死者41例，無壞死者20例，腫瘤內出血者1例；有侵襲轉移8例，無侵襲轉移54例，有動脈期血管強化者（圖1B）37例，無動脈期血管強化者25例。動脈供血型（圖1A-D）52例，雙重供血型及門靜脈供血型10例。GPC-3陽性表達者30例占48.4%，HSP70陽性表達者45例占72.6%（圖1E-F）。HCC>3 cm、動脈期有血管強化、供血類型為動脈型者GPC-3表達明顯高于對照組，差異有統計學意義（P
2.2 肝癌的CT表現與病理分級的關系
本組62例HCC，Edmondson-Steiner分級Ⅰ～Ⅱ級39例，Ⅲ～Ⅳ級23例；肝癌的Edmondson-Steiner級別越高，腫瘤越大、邊緣越不清楚、瘤內越容易出血壞死，差異有統計學意義（P
3 討 論
肝癌在世界范圍內是最常見的惡性腫瘤，HCC占原發性肝癌的80%以上。在2012年全世界估計有782 500例新發肝癌患者和745 500例肝癌死亡患者。而其中約一半的新發病例和死亡患者都發生在中國[8]，我國肝癌的診療形勢嚴峻。對于術前肝癌的診斷臨床常通過影像圖像結合患者血清AFP升高水平和/或穿刺活檢進行判定。臨床上對不同時期肝癌的治療方法差別很大，早期肝癌患者可以通過手術完全切除，患者能獲得較長的無復發生存期，晚期肝癌患者常通過部分切除、射頻消融、動脈化療栓塞、放射性粒子植入再結合放化療等姑息性治療延長患者的生存時間。如果能通過CT圖像對肝癌患者進行一個較為準確的初期評估，對患者的進一步檢查、治療及預后的判斷都將有非常重要的意義。
通常認為，肝癌的病理分級越高，惡性程度越高；肝癌直徑越大，其向惡性轉變越明顯。有研究顯示，當肝癌直徑生長至3 cm時，是其生物學行為由相對良性向高度惡性轉變的重要時期，小于3 cm肝癌多表現為分化好，膨脹性生長、微血管浸潤和衛星結節發生率低等相對溫和的生物學行為，具有根治性治療的病理學基礎；大于3 cm肝癌發生微血管浸潤、衛星結節及不良預后的風險明顯增加，而且總的生存期及無復發生存期也明顯低于小于3 cm肝癌患者[9]。早期肝癌向周圍浸潤少，常表現為邊緣清楚，在HCC與癌旁組織之間沒有或者有不完整的纖維性包膜。隨著肝癌的進展，腫瘤逐漸由門靜脈供血轉變為肝動脈供血，門靜脈供血不斷下降，表現為增強掃描動脈期明顯強化，門靜脈及平衡期強化程度低于肝實質的“洗脫”樣表現，這是診斷肝癌的最重要的影像學征象。由于進展期肝癌呈惡性克隆性增殖，需要大量血供提供細胞增殖所需的營養物質，腫瘤周圍可出現迂曲增粗、增多的異常供血血管，在影像上表現為瘤周或瘤內迂曲走形的動脈期血管強化影。但是當腫瘤生長速度與腫瘤供血不匹配時，瘤內病灶可出現缺血性壞死。由于腫瘤血管結構的不完整性和/或腫瘤對血管的浸潤破壞，也可表現為腫瘤內的出血。包膜是進展期肝癌的征象之一，其組織成分可以為富含纖維組織的真包膜，也可為纖維組織和擴張的肝血竇組成的假包膜[10]。完整的腫瘤包膜可以限制肝癌向外擴散轉移，當進展期肝癌突破包膜向外生長時，表現為包膜不完整或者在影像上表現為腫瘤邊緣不清楚。
GPC-3是分子量為60 kDa的硫酸乙酰肝素蛋白多糖，通過糖基化磷脂酰肌醇錨定在細胞膜表面，其在胎兒肝臟中表達豐富，在成人肝臟中不表達，當肝癌發生時，可被激活并通過整合素、胰島素樣生長因子-Ⅱ和Wnt信號通路等傳導通路促進肝癌細胞的生長[3]。本研究顯示當HCC直徑大于3 cm時，其GPC-3表達率升高，在動脈期血管強化組和動脈供血型中，GPC-3的表達也高于對照組，這表明肝癌的CT表現能夠在一定程度上反映GPC-3的表達水平。病理對照顯示肝癌組織的病理分級越高GPC-3表達水平越高。本研究結果與Bin Yan等[11]的研究結果基本一致，其結果顯示GPC-3過表達和HCC的病理分級、肝內轉移明顯相關，GPC-3陽性表達者HCC的腫瘤更大，而與是否有腫瘤包膜無關。本研究結果顯示HCC中總的GPC-3表達率為48.4%，低于Bin Yan等[11]的研究結果（65%），@可能與本研究所納入的病例較少有關。
熱休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）為高度保守的蛋白，在正常情況下低表達，在休克、缺血、遺傳毒性藥物、營養物質缺乏和腫瘤蛋白高表達等細胞應力條件下表達升高。熱休克蛋白依據其分子量的大小，可分為HSP27， HSP70 和HSP90等，其都與惡性腫瘤密切相關，HSP70在細胞凋亡信號傳導，HCC細胞移行和生成中扮演重要的角色[4～5]。本研究顯示，肝癌動脈供血型中HSP70表達高于門靜脈及雙重供血型，但與肝癌的大小、邊緣、瘤內出血壞死、動脈期血管強化無關；病理高級別的HCC中HSP70表達高于低級別。Shin E等[12]研究認為HSP70與腫瘤大小、Edmonson-Steiner分級及腫瘤是否有包膜相關，瘤體越大、病理分級越高，HSP70表達越明顯，腫瘤有包膜者比無包膜者HSP70表達要低，HSP70還可以作為鑒別HCC是否轉移的指標， HSP70表達水平和血管浸潤有關。本研究中HSP70的表達率為72.6%，與其研究結果（71.9%）趨同。
僅通過肝癌CT表現能不能準確反映肝癌的病理分化級別？筆者檢索國內文獻發現該研究鮮有報道，而做病理對照的較多。黃娟等人[7]將肝癌的血供特點與其病理分化程度作了對比，認為HCC分化程度較好時（Edmondson Ⅰ～Ⅱ級）腫瘤可以接受肝動脈、門靜脈或雙重供血，隨著HCC分化程度的降低（EdmondsonⅢ～Ⅳ級）病變則以肝動脈供血為主。本研究結果顯示HCC的血供特點與其病理分化程度并無相關性，但是HCC的大小、邊緣、瘤內出血壞死與其病理分級密切相關，即HCC直徑較大、邊緣不清、瘤內出血壞死者Edmondson-Steiner分級較高，提示肝癌的CT表現對肝癌病理分化的評估有一定意義。
總之，我們認為HCC的CT征象能在一定程度上反映肝癌的病理分化程度和GPC3、HSP70表達水平，可以豐富肝癌的臨床診斷信息，增加臨床醫生的診斷信心。但是本研究納入的病例數較少，其結果可能存在一定的偏倚，需要更大樣本的研究結果加以確認和補充。
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作者單位：241000 皖南醫學院弋磯山醫院
通訊作者：徐祝軍
【摘要】 目的 通過對損傷的大鼠脊髓早期不同時機減壓后測定脊髓組織中熱休克蛋白（HSP）70的表達及其與神經細胞凋亡的相關性研究，評價早期減壓的療效。方法 采用環扎法建立大鼠脊髓損傷模型，隨機將大鼠分為4組，對照組、8 h脊髓減壓組（實驗B組）、72 h脊髓減壓組（實驗C組）和不減壓組（實驗D組），并分別在1 d、3 d、7 d、14 d和21 d處死后取各組大鼠受損脊髓進行HE染色，免疫組化法、光密度測量法觀察脊髓細胞HSP70的表達，TUNEL法觀察神經細胞的凋亡。應用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析。結果 實驗組HSP70、TUNEL陽性細胞數及HSP70積分光密度各組組間比較差異均有統計學意義（P
【關鍵詞】 脊髓損傷； 減壓時機； 光密度； 熱休克蛋白70； 細胞凋亡
The research of relationship between HSP70 and neuronal apoptosis measured by optical density in rats treated with Cerclage spinal cord injury and decompression at different early time GU Wen-hao,HU Lan-xiang,XU Zhu-jun,et al.Yijishan Hospital of Wannan Medical College，Wuhu 24100，China
【Abstract】 Objective To investigate relationship between HSP70 and neuronal apoptosis measured by optical density in rats treated with cerclage spinal cord injury and decompression at different early time,and to evaluate the efficacy of early decompression.Methods Cerclage rat model of spinal cord injury, rats were randomly divided into four groups,divided into control group,eight hours of spinal cord decompression group,72 hours spinal decompression group and non-decompression group,in 1 d,3 d,7 d,14 d and 21 d of each group were killed after spinal cord damage in rats with HE staining, immunohistochemistry,optical density measurement of spinal cord cells, the expression of HSP70,TUNEL apoptosis of nerve cells was observed. SPSS 17.0 statistical software for data analysis.Results Experimental group HSP70,TUNEL-positive cells and HSP70 integrated optical density were significantly different, each group P
【Key words】 Spinal cord injury; Decompression time; Optical density; Heat shock protein70; Cell apoptosis
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.02.005
脊髓損傷（SCI）的發病率隨著現代交通業的發展而升高，手術減壓治療急性SCI是一種切實可行的治療方法，但是在對SCI選擇傷后干預性手術治療時間點上，各臨床治療中心尚沒有達成共識[1]。為探討早期不同時機減壓療效，本實驗采用環扎法建立大鼠脊髓損傷模型，對損傷的脊髓早期減壓，應用免疫組化法觀察HSP70的表達及TUNEL陽性細胞數，光密度測量脊髓細胞的HSP70表達陽性面積，觀察HSP70表達與神經細胞凋亡的關系，觀察早期減壓療效。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組 84只雄性、13周齡、清潔級Sprague-Dawley大鼠，體重270～320 g，平均290.5 g。由浙江省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(浙)20080033。使用隨機數字表、安全隨機法，分為4組。對照組即A組：僅行椎板切除，n=12，實驗組分為B組：8 h脊髓減壓，n=24；C組：72 h脊髓減壓，n=24；D組：環扎術后不行脊髓減壓術，n=24。分別于手術后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d處死后取出脊髓標本。
1.2 主要試劑 （1）Rabbit Anti-Hsp70；（2）即用型SABC試劑盒；（3）細胞凋亡檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；（4）0.01PBS(PH7.2-7.4)；（5）0.01枸櫞酸緩沖液（PH6.0）；（6）DAB顯色試劑盒；（7）胃蛋白酶消化液(北京中杉金橋生物有限公司)；（8）4%甲醛(皖醫弋磯山醫院實驗外科)。
1.3 動物模型建立 采用環扎法建立大鼠脊髓損傷模型[2]。以5-0普通白色絲線環扎大鼠胸腰段硬脊膜囊建立大鼠急性脊髓損傷壓迫模型。1%戊巴比妥鈉，30～40 mg/kg，大鼠腹腔內給藥麻醉，以T13棘突為中心，取后入路，咬除T13椎板。10倍顯微鏡下，用測量線環形測量硬脊膜囊周長，測出硬脊膜囊周長(C1)，經代數運算(C2=C1×0.7)獲得將硬脊膜囊截面壓縮至原截面積70%的周長(C2)，將原測量平面將硬脊膜囊環扎至原截面積的70%。結扎后依層縫合。B組8 h脊髓減壓，取出環扎線；C組72 h脊髓減壓，取出環扎線。D組保留環扎線。術后常規護理。
1.4 標本采集、制備與HE染色 大鼠模型分別在手術減壓后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d五個時間，將對照組和脊髓損傷組的大鼠經心臟灌注取材，灌注后脊髓已被多聚甲醛固定變硬，以環扎損傷部位為中心、取出其上下段共1.5 cm脊髓組織，浸泡于相同甲醛溶液中后固定72 h。損傷下端0.5 cm以4 μm厚度切片，脊髓取冠狀面，撈片于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，標簽晾干玻片分別行HE染色。
1.5 免疫組織化學染色 分別取脊髓損傷下端組織切片用Rabbit Anti-Hsp70抗體進行SABC免疫組織化學染色，使用DAB顯色試劑盒，TUNEL法觀察神經細胞的凋亡水平，使用DAB顯色試劑盒染色檢測，所有實驗步驟嚴格按照該試劑的標準和流程進行。使用數碼相機（NIKON-4300日本)對顯色的圖片攝像。
1.6 光密度測量 在普通光學顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察每組不同時間下染色特點。每一染色切片隨機取5個高倍視野(10×40)進行顯微攝影(Nikon Eclipse 80i顯微成像系統)獲取圖像，調試完成后，維持采集的各項設置不變，一次性采集出所有樣本的圖像，每張切片至少隨機采集5個視野。使用圖像分析軟件（Image－Pro Plus 6.0美國）對每張切片進行光密度測定。積分光密度(IOD)可反映所測結構的光密度與面積的綜合變化，IOD與物質的質量成正比，其數值反映物質的相對含量 [3，4]。
1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，各組數據采用均數±標準差（x±s）表示，四組數據均呈正態分布，方差齊性檢驗采用比較均值單因素方差同性檢驗，組內組間比較采用一般線性模型單變量方差檢驗，HSP70陽性細胞數與神經細胞凋亡細胞數相關性采用直線相關分析。以P
2 結果
2.1 HSP70積分光密度 使用圖像分析軟件（Image－Pro Plus 6.0美國）對每張切片進行光密度測定，在400倍每張切片至少隨機采集5個視野。A組偶見陽性面積，各時間點無顯著差異。陽性面積D組高于C組，C組高于B組，實驗組術后1 d陽性面積增加，術后3 d到達高峰，術后7 d有所降，術后21 d仍然有所表達。實驗組組間比較差異有統計學意義（P
2.2 HSP70免疫組化陽性細胞數結果 光鏡下分別觀察各組各時間點脊髓損傷下端的組織變化，以細胞漿和（或）核棕黃色著色為陽性細胞，在400倍視野下每張切片于灰質取5個視野，分別計數每個視野的陽性細胞數。A組偶見免疫陽性細胞，各時間點無顯著差異（見圖1：A）。陽性細胞數，D組高于C組，C組高于B組，實驗組術后1 d免疫陽性細胞增加，術后3 d到達高峰，術后7 d有所降，術后21 d仍然有所表達。實驗組圖片見圖1:B、C、D、E、F。實驗組組間比較差異有統計學意義（P
2.3 Tunel凋亡細胞 凋亡細胞呈棕褐色和棕黃色，胞核固縮顆粒深染，形態不規則，為散在和彌散性分布于損傷區域及周圍。在400倍視野下每張切片于灰質取5個視野，分別計數每個視野的陽性細胞數。對照組少見凋亡細胞。凋亡細胞數，D組高于C組，C組高于B組，實驗各組術后1 d出現大量凋亡細胞，術后3 d達到高峰，術后7 d、14 d、21 d凋亡細胞逐日減少。各組組間比較差異有統計學意義（P
2.4 HSP70陽性細胞與Tunel細胞凋亡的相關性分析 實驗組不同時間點熱休克蛋白70陽性細胞、tunel陽性細胞數比較差異均具有統計學意義，兩者線性相關系數r=0.685～0.971，對r值進行t檢驗的假設檢驗，P
3 討論
目前治療脊柱脊髓損傷的主要方法是及時徹底地減壓和恢復脊柱穩定性，減少繼發性損傷[1]。目前認為細胞凋亡是繼發性脊髓損傷的重要組成部分，繼發性脊髓損傷中出現的神經元和神經膠質細胞死亡都是繼發細胞凋亡的結果[5]。
注：A：空白對照組；B：8 h減壓術后3 d；C：8 h減壓術后21 d；D：72 h減壓術后3 d；E：72 h減壓術后21 d；F：未減壓術后3 d
當發生脊髓損傷后局部熱休克蛋白（HSPs）的表達增加，可對抗脊髓繼發性損傷神經細胞凋亡是脊髓繼發性損傷的主要機制之一，HSPs可通過以下機制抑制神經細胞凋亡：抑制內源性（線粒體內caspase依賴的）凋亡途徑，抑制外源性（受體介導的）凋亡途徑，調節Bcl-2家族成員的活性促進核轉錄因子的活化，抑制一氧化氮(NO)的大量產生減少自由基的毒性作用[6]。其中HSP70屬于誘導型HSP70，其在正常細胞中不表達或表達量很少，但在應激源刺激下，表達量顯著增加[7]。實驗證實HSP70對細胞保護作用，其誘導的數量與保護作用的強弱呈正相關[8]。邵將等[9]實驗顯示，HSP70表達隨時間的延長逐漸增強，損傷后24～48 h達到頂峰，在此期間組織內所有細胞均可見HSP70的陽性表達，這種表達一直持續到損傷后72 h。與本次實驗HSP70表達的高峰期較為接近。由于HSP70屬于誘導型HSP，其誘導的機制尚不完全清楚，所以單純手術干預不能誘導其表達增加。因此在今后的研究中，對損傷的脊髓早期減壓的同時，短時間誘導出大量HSPs，達到更好地抗脊髓繼發性損傷神經細胞凋亡，將是未來治療脊髓損傷的新路徑。
參 考 文 獻
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一、心肌預缺血現象
心肌預缺血保護是指預先使心肌經歷數次短暫缺血(不至造成不可逆的損傷)，可使其對隨后較長時間的缺血和再灌注造成的損傷產生抵抗作用。這一適應性的保護反應首先由Murry等［3］發現并報道。實驗犬心肌局部經歷數次短暫重復的缺血，預想將造成累積性的ATP消耗。但結果發現，經歷首次缺血后，心肌ATP含量并沒有隨著后面數次缺血進一步減少，7條犬中6條沒發生心肌梗死。這一結果與當時普遍接受的觀點相矛盾，即重復缺血可造成心肌梗死。進一步實驗發現，阻塞犬冠狀動脈分支5分鐘，接著開放5分鐘，重復4次，然后經歷40分鐘缺血，結果心肌梗死面積只有對照組(沒有經歷4次預缺血)的25%。在實驗動物上引發預缺血保護，理想的預缺血時間是2～5分鐘，間隔同樣或長一倍的時間，如此重復2～5次，可達到最佳保護效果，又不會造成心肌梗死和室顫［4］。預缺血使心肌在幾分鐘之內產生保護作用，但持續時間很短，2～4小時后大部分喪失，這一快速適應性保護稱早期預缺血保護［5］。隨后的研究發現另外存在一種緩慢產生的保護，稱延遲預缺血保護，在預缺血24小時后效果明顯，持續到72小時以后［4］。隨著研究的深入，預缺血的含義被擴大了，引發預缺血保護的方法包括：離體心臟低氧灌注，快速心臟起搏，熱刺激，內毒素和基因轉移。預缺血保護不但在許多動物如大鼠、兔、犬、豬，而且在人類心臟上也被證實。
二、心肌預缺血保護的機制
近年來學者們對心肌預缺血保護的機制做了大量研究，認為早期預缺血通過受體激活細胞內信息傳遞鏈，激活蛋白激酶，而后使ATP依賴性鉀通道(KATP)開放產生保護作用［6］。延遲預缺血保護的機制尚不清楚。但許多作者認為與細胞內信息傳遞鏈激活和蛋白合成有關［7］。
1.早期心肌預缺血的保護機制有證據表明缺血時神經內分泌應激激素如腺苷、去甲腎上腺素、緩激肽、內皮素、血管緊張素Ⅱ、乙酰膽堿的釋放與早期預缺血保護有關，而蛋白質的合成則與此保護無關［8］。有實驗表明使用腺苷可使心肌產生預缺血樣保護，而在預缺血期或后缺血期使用腺苷受體拮抗劑或腺苷脫氫酶則可消除保護作用［9］。腺苷受體與G蛋白結合，腺苷與受體結合后，G蛋白從結合體中傳遞信息給效應酶和離子通道［10］。預缺血也可以增加G蛋白的活性。其他應激激素受體如α1腎上腺素能受體、血管緊張素受體、緩激肽受體、內皮素受體、乙酰膽堿能受體均與G蛋白結合并通過其傳遞信息［11］。G蛋白傳遞信息給與它結合的磷脂酶C(phospholipaseC)使其激活，后者使細胞膜磷酸肌醇水解，產生兩種細胞內第二信使，一種是三磷酸肌醇，可引起細胞內非線粒體鈣釋放；另一種是二環甘油(diacylglycerol,DAG)。DAG可使本來處于細胞漿內非激活狀態的蛋白激酶C(proteinKinaseC,PKC)移到細胞的雙層脂膜上，等待后缺血期激活［12］。蛋白激酶C有幾種異構體，預缺血時誘導的是新型的鈣非依賴型酶。該酶在后缺血和再灌注期通過上述腺苷激活鏈被激活，它可激活KATP［13］，另外后缺血期心肌細胞內ATP含量降低也可開放KATP。KATP激活后，鉀離子外流，心肌動作電位平臺期縮短，鈣離子內流減少，在亞細胞水平維持鈣離子循環所需的高能磷酸鍵減少，心肌收縮功能減弱，能量需要減少，從而保護了心肌。鉀通道開放后亦可顯著減輕由白細胞釋放氧自由基引起的心肌損傷［14］。
2.延遲預缺血保護機制目前對延遲預缺血的保護機制研究處于初期階段，有學者認為這一保護的激發因子和信息傳導鏈與早期保護相同。延遲預缺血與蛋白質的基因轉錄、合成和降解在時間上相吻合，且使用蛋白合成抑制劑可消除延遲保護，故蛋白合成被認為與這一保護機制有關。熱休克蛋白(heatshockprotein,HSP)和抗氧化酶在許多實驗中被證實能產生延遲保護作用。預缺血后心肌延遲產生的抗氧化酶可清除后缺血和再灌注期產生的氧自由基。
熱休克蛋白是心肌遇熱刺激后產生的一種反應性蛋白，正常心肌組織中含量較低，它可防止新合成的多肽鏈誤折和誤聚，使其穿過生物膜，并作為補體作用于新合成的多肽鏈使其有機地折迭和組合。預缺血2小時后，免疫組化測定顯示HSP70mRNA含量增高，于24小時后回到正常水平，與此同時HSP明顯升高［4］，于72小時后開始下降，其含量與心肌保護作用的程度成正相關，被認為是哺乳動物中作用最強的心肌保護蛋白。它可使損傷的蛋白質多肽鏈解聚，以便重新折迭和組合，恢復活性。有作者［16］認為熱休克蛋白可維持抗氧化酶的活性，增強其清除氧自由基作用。另外，有實驗證明熱休克蛋白含量與心肌細胞凋亡(apoptosis)數量成反比，而與細胞核轉錄因子(NF-kB)活性成反比，故提出熱休克蛋白通過抑制NF-kB的活性減少心肌細胞的凋亡［17］。
三、心肌預缺血保護的臨床價值
預缺血保護在臨床上也已得到證實和應用。在心肌梗塞前有數次心絞痛發作(預缺血)的冠心病人與無心絞痛發作的病人相比，其梗死面積小，心源性休克及充血性心衰發生率低。心內直視術中引進預缺血，心肌保護明顯優于單用冷晶體停跳液或氧合血停跳液者［18］。低溫亦可增強預缺血保護效果。對高危心臟手術病人引入這一內源性的保護機制，可望達到理想效果。
四、研究展望
1.機制方面雖然腺苷-蛋白激酶C-KATP這一預缺血保護的激活途徑得到大多數學者認可，但也有作者觀察到預缺血并不改變后缺血和再灌注對動作電位的影響；KATP作為最終作用因子亦受到有些學者懷疑。在延遲保護方面，信息傳遞鏈與熱休克蛋白和抗氧化酶合成的關系尚不明確。有實驗提出在延遲保護實驗中，熱休克蛋白和抗氧化酶并不升高。以上方面均需進一步探討。
Proteomic analysis of human bone marrowderived mesenchymal stem cells induced to differentiate into osteoblasts
【Abstract】 AIM: To analyze the difference of protein profiles between human bone marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) and osteogenic differentiated MSCs by proteomic approach. METHODS: The MSCs were isolated primarily from bone marrow of adults and detected in cell purity by flow cytometry analyzing cell phenotypes and in cell function by multilineage potential test. The undifferentiated MSCs and osteogenic differentiated MSCs over a period of 14 d were collected and cell total proteins were extracted for finding out the differential expression by proteomic analysis including 2D gel electrophoresis and Peptide Mass Fingerprinting technology. RESULTS: Twentythree differentially expressed proteins were identified by MALDITOFMS analysis. CONCLUSION: Proteomic approach is a high throughput method to screen the key proteins which play important roles in MSCs osteogenic differentiation.
【Keywords】 proteomics; mesenchymal stem cells; protein expression
【摘要】 目的: 探討用蛋白質組學方法分析人骨髓間充質干細胞（MSCs）定向成骨細胞誘導分化中細胞蛋白表達譜的改變. 方法: 從人骨髓細胞中分離獲得MSCs，經細胞表型及多向分化能力測定鑒定MSCs的純度和功能后，采用定向成骨細胞分化誘導培養體系，于分化后14 d分別提取未分化細胞及分化后細胞的總蛋白，雙向電泳分析，確定蛋白差異點，經酶切后行蛋白肽質量指紋譜鑒定差異蛋白表達. 結果: 雙向電泳找到38個蛋白差異點，質譜分析鑒定出23個差異蛋白分子表達. 結論: 用蛋白質組學方法可高通量篩選與MSCs定向誘導成骨細胞分化相關的重要蛋白.
【關鍵詞】 蛋白質組學；間質干細胞；蛋白表達
0引言
間充質干細胞(mesenchymal stem cells， MSCs)是一群具有向成骨細胞、成軟骨細胞和脂肪細胞分化能力的干細胞，存在于成體的骨髓、骨、脂肪和肌肉等組織中. MSCs體外貼壁性使之易于分離純化，且體外培養的MSCs增殖能力強，是一種具有重要應用價值的種子細胞［1］. 但有關MSCs定向分化的分子機制尚不清楚. 為探討MSCs定向成骨分化過程中細胞內可能具有調控作用的蛋白分子的變化，我們首先從人骨髓單個核細胞中分離獲得MSCs，對所獲得的MSCs進行了細胞表型及多向分化能力測定，在鑒定MSCs的純度和功能后，采用定向成骨分化誘導培養體系誘導MSCs定向成骨細胞分化，對未分化MSCs及分化后細胞總蛋白進行提取，經雙向電泳比較蛋白差異點，選擇差異點蛋白，酶切后進行蛋白點肽質量指紋譜鑒定分析.
1材料和方法
1.1材料
骨髓取自食道癌手術患者，年齡56～67歲. 主要試劑Dulbeccos modified Eagles medium（DMEM）培養基為Gibco產品，胎牛血清為Stem cell產品，Percoll為Amersham Pharmacia產品，CD34，CD45，CD73，CD105，CD166單克隆抗體為BD公司產品，胰酶、地塞米松、β－甘油磷酸鈉、抗壞血酸、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)染色試劑盒、CHAPS為Sigma產品，IPG干膠條(pH310，18 cm)為Amersham Pharmacia產品，碘乙酰胺為Fluka產品，標準蛋白BSA為Pierce產品，其他試劑由本室提供.
1.2方法
1.2.1人骨髓MSCs的分離培養Percoll分離人骨髓單個核細胞，2×105細胞/cm2密度接種于塑料培養瓶中，培養體系為含100 mL/L經篩選胎牛血清的高糖DMEM，48 h后去除非貼壁細胞，每隔3 d換液，至貼壁細胞0.80融合時按3000細胞/cm2接種傳代.
1.2.2人骨髓MSCs的鑒定收集3代以后的細胞，按1 μL/1×106細胞分別加入PE或FITC直接標記的抗CD34，CD45，CD73，CD105和CD166等單克隆抗體，室溫反應20 min. PBS洗滌后，流式細胞儀檢測，每個反應至少收集5000個點數據. 以加入相應同型抗體細胞作為陰性對照，應用相關軟件分析［2-3］. 按照文獻方法［4］誘導MSCs向成骨細胞分化，用ALP染色鑒定；誘導MSCs向脂肪細胞分化，用油紅染色鑒定；誘導MSCs向成軟骨細胞分化，阿爾辛藍染色鑒定.
1.2.3雙向電泳
1.2.3.1雙向電泳蛋白質樣品的制備收集3代以后的MSCs和向成骨誘導分化的細胞，用冷的PBS洗2遍后，加入細胞裂解液(8 mol/L尿素，40 g/L CHAPS，40 mmol/L Tris base)，混勻后用液氮反復凍融，再加入適量RNA酶和DNA酶，冰浴20 min. 4℃離心(14 000 g，30 min)，取上清，Bradford法定量，分裝，-70℃保存.
1.2.3.2第一向固相PH梯度等電聚焦（IEF）100 μg（銀染）或1 mg（考染）蛋白與重泡漲液（8 mol/L尿素，20 g/L CHAPS，5 μL/L IPG緩沖液，20 mmol/L DTT，痕量溴酚藍）混合，行等電聚焦，重泡漲與等電聚焦在16℃，以設定程序進行，總電壓時間為80 000 V?h.
1.2.3.3平衡等電聚焦結束后，每根IPG膠條用8 mL含SDS的平衡液（50 mmol/L Tris?Cl (pH 8.8)，6 mmol/L尿素，300 mL/L甘油，20 g/L SDS，痕量溴酚藍）平衡兩次，每次15 min，第一次為還原過程，平衡液內加20 mmol/L DTT；第二次平衡為烷基化過程，平衡液內加100 mmol/L的碘乙酰胺.
1.2.3.4第二向垂直平板電泳（SDSPAGE）將平衡好的IPG膠條轉移至130 mL/L的丙烯酰胺膠上分離，堿性端旁置蛋白分子量Marker，行SDSPAGE.
1.2.3.5染色及凝膠圖像采集分析SDSPAGE膠在硝酸銀染色時須經過固定、增敏、顯色三步；在考馬斯亮藍染色時，則須染色3 h，然后脫色. 染色后的雙向電泳凝膠用凝膠圖像掃描儀透射掃描，數字化圖象文件采用Amersham Pharmacia公司的二維電泳處理軟件（ImageMasterTM 2D Elite 3.01）分析，結合目視，從分子量、等電點等方面比對蛋白分子差異點.
1.2.4蛋白點肽質量指紋譜鑒定
1.2.4.1切膠、脫色、干燥將電泳后凝膠中蛋白質點切出，用干凈的解剖刀將膠塊切成約1～2 mm3大小，去離子水沖洗，除盡殘留的SDS. 用含500 mL/L乙腈、25 mmol/L NH3HCO3的溶液100～200 μL，渦旋混合器震蕩約30 min，重復此操作直至膠塊中的藍色完全褪盡. 將膠塊在真空干燥器內干燥約20 min.
1.2.4.2酶切及肽段提取在干燥好的膠塊上加入3～7 μL胰蛋白酶液（0.01 g/L，配于25 mmol/L NH4HCO3溶液內），4℃放置15 min使酶液完全被吸收，補加5 μL 25 mmol/L的NH4HCO3溶液保濕，37℃溫育18～20 h. 收集酶切后的上清，在膠塊內加50～100 μL 50 g/L三氟乙酸于40℃放置1 h，收集上清；再加入25 g/L三氟乙酸、500 mL/L乙腈50～100 μL于30℃放置1 h，收集上清；合并上清液離心干燥.
1.2.4.3肽混合物的PMF分析在干燥后的肽混合物內加入3～7 μL 50 g/L三氟乙酸，混勻后，取0.5～1 μL溶液和等體積飽和基質溶液混合，然后加至不銹鋼靶上，室溫干燥，裝靶測定：20 kV，陽離子模式下在Bruker REFLEX Ⅲ型MALDITOFMS(BrukerFranzen， Bremen， Germany)質譜儀上獲取數據，用Mascot(matrixscience.cn)軟件在NCBInr數據庫內進行檢索.
2結果
2.1人骨髓MSCs形態骨髓單個核細胞于3 d左右開始伸出突起，2～6 d時細胞增殖較緩慢，逐漸長為梭形，7 d開始細胞增殖迅速，細胞呈旋渦狀生長，14 d左右逐漸達到完全融合(圖1).
2.2流式細胞學分析MSCs表型研究表明，MSCs具有多種標志分子，有造血干細胞生長因子及間質細胞、基質細胞抗原和細胞外基質受體的表達， 但并不表達CD45，CD34等造血干祖細胞的表面標志. 通過流式細胞學分析，培養的MSCs表達CD73，CD105，CD166，不表達CD34，CD45(圖2).
2.3MSCs功能鑒定ALP染色鑒定MSCs向成骨誘導分化，ALP染色MSCs陰性，成骨細胞陽性；油紅染色鑒定MSCs向成脂肪誘導分化，油紅染色MSCs陰性，成脂肪細胞陽性，可見脂滴堆積；阿爾辛藍染色鑒定MSCs向成軟骨誘導分化，成軟骨細胞陽性，存在大量蛋白聚糖基質. 通過MSCs表型和MSCs功能鑒定證實，我們獲得了從人骨髓單個核細胞分離培養的MSCs細胞(圖3).
2.4雙向電泳顯示蛋白質差異點的變化MSCs與成骨細胞凝膠圖像存在多個蛋白差異點，選取38個差異點，切膠作質譜分析. 經過鑒定，共有23個差異點鑒定出差異蛋白(圖4).
2.5質譜分析鑒定差異蛋白鑒定結果表明，大多數蛋白點的出峰情況較好［部分蛋白分子差異點的肽質量指紋譜（PMF），圖5］. 用MALDITOF/MS結果進行檢索就可以得到比較確定的鑒定結果. 質譜鑒定MSCs和向成骨誘導細胞蛋白差異點的詳細情況見表1.表1質譜鑒定的差異蛋白（略）
3討論
骨髓間充質干細胞具有多向分化潛能，研究證實MSCs可以分化為成骨細胞、成軟骨細胞、成肌細胞、脂肪細胞，MSCs還可分化為神經元細胞、神經膠質細胞、心肌細胞、內皮細胞. 這些研究結果表明，間充質干細胞已超越了傳統意義上只能分化為間質組織的概念. 細胞分化的實質是細胞內基因的選擇性表達，導致細胞新的特異性的蛋白質的合成，從而在生化、結構及功能上發生變化. 對細胞內基因的結構與功能的研究最終需定位于細胞內蛋白質的結構與功能的研究. 因此我們應用蛋白質組學實驗技術檢測MSCs定向誘導分化為成骨細胞后蛋白表達的差異，期望發現對MSCs的誘導分化起作用的調控蛋白，從功能蛋白質組學的高度闡述MSCs分化過程中其相關蛋白質的含量與修飾的變化，以便更深入地闡明MSCs定向分化的分子機制. 我們經過篩選，從38個蛋白差異點中鑒定出23個差異蛋白. 在這些差異蛋白中，微管蛋白和骨架蛋白占相當大的比例，如Moesin，β微管蛋白、cofilin 1，平滑肌蛋白、SM22alpha. 由于MSCs誘導分化成成骨細胞，微管蛋白和骨架蛋白的表達必然增加. 我們也找到了2個感興趣的差異蛋白：熱休克蛋白27和KIAA0120. 熱休克蛋白27是熱休克蛋白家族中的一員，作為一種分子伴侶，它參與一系列細胞活動，包括細胞內蛋白聚集的抑制、細胞骨架蛋白的動力學、細胞生長與細胞分化等. 熱休克蛋白27的誘導和表達與肌動蛋白和微管蛋白的結構建造緊密相連，通過磷酸化作用穩定細胞肌絲，從而在細胞保護方面發揮作用［5-6］. 近年來的研究證實，熱休克蛋白27通過幾種不同的機制參與細胞凋亡，有關熱休克蛋白27參與細胞凋亡的信號傳導通路已經成為這一領域研究的熱點之一. 熱休克蛋白27能維持細胞內氧化還原的動態平衡和線粒體的穩定，通過與細胞色素C的相互作用，調節細胞行使細胞凋亡功能［7］. 在以后的實驗中，我們會圍繞熱休克蛋白27基因和蛋白作一些相關研究. 我們另一個感興趣的差異蛋白是KIAA0120. KIAA0120是KIAA家族中的一員. 目前對KIAA的研究主要集中于基因水平，對KIAA蛋白的結構與功能所知不多［8-9］. 我們應用反轉錄PCR（RTPCR）方法觀察到MSCs定向誘導分化為成骨細胞后，KIAA1077基因的表達上調（資料未顯示）. 對KIAA基因和蛋白的研究也是我們以后研究的重點之一.
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調節體溫 讓孩子適度出點汗，可幫助體內排出多余的熱量，維持體溫的恒定，有效減少熱對酶和結構蛋白質的傷害，增強免疫力，維護孩子的健康。
防范中暑 兒童是中暑的高發人群，這與有些孩子體內的熱休克蛋白數量過低有關。熱休克蛋白是指細胞在應激原特別是環境高溫誘導下所生成的一組蛋白質。如果長期享受空調，怕熱怕流汗，不進行耐熱鍛煉，體內的熱休克蛋白數量就少。
抵御病菌 汗液中的乳酸與皮脂腺分泌的脂肪酸，是殺滅病原微生物的化學武器，可殺死皮膚表面大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和白色念珠菌等致病菌，維持皮膚的生態平衡，防范癤癰等皮膚病。
幫助排毒 皮膚是最大的排泄器官，人體內每天會產生大量的代謝廢物，并隨著汗水排泄出去，從而使人體內環境保持潔凈，各臟器發揮正常的生理功能。
增進食欲 孩子活動出汗后，促進了身體的氣血運行，胃腸道的蠕動和消化液的分泌正常，有利于對食物的消化吸收，胃口好，吃飯香。
出汗是夏天孩子保健的法寶，因此我們要注意維護好孩子的汗腺健康――
防止汗腺疲勞
汗腺分泌的汗液中99％是水分，其余是氯化鈉、氯化鉀、水溶性維生素及尿素等。夏季天氣炎熱，出汗過多會丟失眾多物質，影響機體的健康。比如，鈉離子丟失太多就無力統帥“水兵”，汗腺會不停地分泌汗液，如不及時補充鹽分，時間一長，汗腺就會發生疲勞，影響排汗功能。體內缺少鹽分，水分丟失過多，水和電解質的平衡失調，體溫調節中樞失靈而導致中暑，嚴重者危及生命。
因此，夏天要注意孩子的飲食營養，合理調配膳食，平時常吃些新鮮蔬菜瓜果，補充維生素及礦物質。孩子在外面跑跳玩耍時常會汗水淋漓，媽媽可讓孩子多次少量喝些淡鹽開水、綠豆湯或防暑的清熱飲料；西瓜是消暑佳品，享有“天然白虎湯”之美稱，每天吃點西瓜大有裨益。同時要給孩子創造一個溫濕度適宜、空氣清新的室內環境，既避免了孩子出汗過多，又防止汗腺發生疲勞。
保持皮膚清潔
夏天孩子出汗多，如不注意衛生，皮膚極易變臟，灰塵污垢會堵塞汗孔，影響汗液排泄，容易引起汗孔角質層的炎癥，還會導致汗管破裂，形成痱子，如繼發細菌感染，會變成痱毒或癤癰，嚴重者引起毒血癥或敗血癥。
因此，夏天要天天給孩子沐浴洗澡，保持皮膚清潔，有利于汗腺導管通暢。但洗澡要講究科學，當孩子在劇烈活動后一身大汗時，千萬不能帶孩子到池塘或河水中洗澡，更不可對著自來水猛沖身體，以免熱身子受到冷水的剌激后，皮下血管急劇收縮，汗孔閉塞，引發感冒、急性關節痛等病，嚴重者可導致肢體癱瘓。所以，運動后要休息半小時，等汗干后再去洗澡。洗后及時擦干身體，穿好衣服。
芍藥苷（paeoniflorin，PF）是中藥芍藥的主要有效單體成分。芍藥Paeonia lactiflora Pall具有清熱涼血、散淤止痛、活血化淤、調節免疫之功能。既往研究證明芍藥苷有抗自由基損傷，抑制細胞內鈣超載和抗神經毒性等活性，體內實驗證明其有降低血液黏度、抗血小板聚集、擴張血管、改善微循環、抗氧化、抗驚厥等作用。現經國內外進一步研究，發現其具有神經保護作用。以下對芍藥苷的神經保護作用的研究進展作一綜述，為進一步開發提供依據。
1 對腦缺血-再灌注損傷的保護作用
腦缺血-再灌注損傷后由于腦缺血后腦細胞缺血缺氧，腦細胞膜上Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶失活，ATP含量迅速下降、功能衰竭，造成腦組織能量代謝障礙及自由基連鎖反應，使生物膜的運輸功能發生障礙，引起水和電解質代謝紊亂，而導致腦細胞損傷、水腫。在動物腦缺血-再灌注損傷模型上觀察到芍藥苷有保護作用。
孫蓉等［1］觀察芍藥苷對大鼠腦缺血后再灌注期間血腦屏障及腦缺血神經病理改變癥狀、腦血流量的影響，采用大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷實驗模型，以神經行為學、腦組織含水量、病理組織學檢查、血腦屏障通透性、腦血流量為指標，結果發現與模型對照組比較，局灶性腦缺血1 h再復灌3 d后，應用芍藥苷的各組動物的神經行為學、腦組織含水量、組織病理學改變和血腦屏障通透性均得到改善，大腦局部血流量顯著增加，說明芍藥苷對腦缺血后腦水腫、血腦屏障、大腦局部血流量等具有保護作用；另外［2］，用沙土鼠雙側頸總動脈夾閉腦缺血再灌注模型，于再灌注后48 h取腦皮質測定Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、乳酸、NO和NOS水平，結果發現與假手術對照組比較，缺血再灌注后48 h腦組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性均降低，NO含量和NOS活性降低，而乳酸含量無明顯變化；與模型對照組比較，芍藥苷高、中、低劑量均可不同程度地防止缺血再灌注48 h后Na+-K+-ATP酶活性的降低，增加Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性，增加NO含量，提高NOS活性，結論認為芍藥苷通過調節腦內能量代謝和NO的生成而發揮抗腦缺血作用。
Chen DM等［3］在大腦中動脈閉塞再灌注模型上研究芍藥苷預處理誘導延緩神經蛋白的作用機制，在鼠大腦中動脈閉塞后再灌注24 h的實驗前48 h分別應用20，40 mg/kg芍藥苷預處理能明顯降低死亡率，減少大腦梗塞面積，減少神經細胞丟失。在大腦中動脈閉塞再灌注后24，48 h， 5 d予20 mg/kg芍藥苷也有相似作用；應用比較蛋白組學鑒定芍藥苷預處理誘導的蛋白表達，發現芍藥苷預處理后相關蛋白表達水平改變，20種升高，另22種降低；一系列相關蛋白、分子包括NO系統、神經損害標記物、促分裂素蛋白酶等參與了芍藥苷預處理的作用機制。
Liu DZ等［4］在大鼠短暫性局部腦缺血模型（結扎大腦中動脈1.5 h）及持久局部腦缺血模型上，皮下注射芍藥苷2.5 mg·kg-1 及5mg·kg-1均能減少神經細胞缺失及減少腦梗塞面積，且呈量-效關系；這種神經保護作用能被腺苷A1受體拮抗劑DPCPX所抑制。
2 對慢性動脈性腦缺血的保護作用
Xiao L等［5］在大腦中動脈閉塞模型上觀察芍藥苷的作用，應用大腦中動脈閉塞造成慢性（4周）一過性腦缺血大鼠模型，觀察腦梗塞面積、神經系統癥狀、伸舌動作、水迷宮移動等指標；結果發現1 d（10 mg/kg，2次/d）或7 d（2.5～10 mg/kg，2次/d）皮下注射芍藥苷法均能起減少腦梗塞面積、改善神經系統癥狀等保護作用。
3 保護神經細胞作用
3.1 抑制細胞凋亡 研究證實［6］腦缺血-再灌注損傷后4h出現凋亡細胞，24 h達高峰，并持續到96 h。大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株PC12細胞廣泛應用于神經生理和神經藥理學研究。孫蓉等［7］探討一氧化氮誘導PC12細胞凋亡及芍藥苷的保護作用的機制，應用MTT和乳酸脫氫酶活性測定細胞存活率，DNA凝膠電泳觀察DNA的斷裂情況，流式細胞儀測定細胞凋亡率、檢測線粒體跨膜電位，結果發現硝普鈉(SNP)可誘導PC12細胞凋亡，細胞線粒體跨膜電位明顯下降，預先經過芍藥苷處理后，SNP誘導的PC12細胞凋亡明顯減少，同時明顯減弱一氧化氮對線粒體跨膜電位的影響，說明芍藥苷可抑制一氧化氮誘導PC12細胞凋亡，其作用機制可能與其穩定細胞線粒體跨膜電位有關。
3.2 活化腺苷A1受體，保護神經細胞已知的腺苷受體有4種亞型(A1、A2a、A2b及A3 受體)，均屬于與G蛋白耦聯的受體家族，可與相應的G蛋白耦聯，介導廣泛的生物學效應，進而調節腺苷酸環化酶、鳥苷酸環化酶、離子通道及磷脂酶的活性［8］。腺苷作用于A1受體，可抑制神經元的興奮性，從而降低能量的消耗；另一方面，腺苷可以擴張局部腦血管，增加受損腦區的血流量，從而增加細胞的能量供應［9］。Liu HQ等［10］研究發現芍藥苷有對帕金森病小鼠模型的神經保護作用；皮下注射芍藥苷2.5及5 mg·kg-111 d，在注射第8天時開始注射MPTP 20 mg·kg-1，1次/d，共4次，觀察到芍藥苷能防止黑質及紋狀體神經纖維運動徐緩或死亡；另一實驗方法是先注射4次MPTP，在最后1次注射1 h后皮下注射芍藥苷2.5及5 mg·kg-13 d，1次/d，觀察到芍藥苷能減輕多巴胺能神經變性的作用，且呈量-效關系；用5 mg·kg-1芍藥苷處理能明顯減少MPTP誘發的促炎癥反應因子增量調節及抑制小神經膠質細胞及星形細胞的激活；每次注射芍藥苷前15 min應用腺苷A1受體拮抗劑預處理，能拮抗芍藥苷的神經保護作用；據此推測芍藥苷能活化腺苷A1受體，起神經細胞保護作用。
3.3 對抗興奮性氨基酸海人藻酸所致的神經細胞損傷 吳玉梅等［11］探討芍藥苷是否促進培養皮層神經細胞的存活，并對抗興奮性氨基酸海人藻酸(KA)所致的神經損傷，解剖分離15 d胚胎小鼠皮層神經細胞，接種于24孔板中加藥培養，臺盼藍染色細胞，相差顯微鏡及免疫組織細胞化學方法進行形態學觀察，結果發現:①加入芍藥苷20.8和41.6 mg·L-1培養4 d增加神經細胞存活數量，降低死亡率；②加入KA 50 μmol·L-1 作用30 min，神經元腫脹，失去折光性，核偏位，死亡率增高，預先加入芍藥苷20.8和41.6 mg·L-1 培養4 d，可對抗KA所致的神經損傷，結果證明芍藥苷可增加神經細胞存活數量，降低死亡率，對抗KA所致的興奮性神經損傷，但其機理有待進一步研究。
3.4 與腦星形膠質細胞的關系Liu J等［12］研究芍藥苷對大鼠慢性腦供血不足的保護作用，持續結扎頸動脈7周后，處死大鼠，應用免疫組化技術標記腦海馬神經細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞，結果發現慢性供血不足可致大鼠腦星形膠質細胞、小膠質細胞增多，而應用芍藥苷后這些細胞沒有增多；大鼠慢性供血不足后星形膠質細胞中NF-Kβ表達增加，而芍藥苷能減少NF-Kβ表達。結果表明芍藥苷能減輕慢性腦供血不足引起的認知障礙，可能機制是芍藥苷誘導相關腦神經蛋白生成。我們知道星形膠質細胞的作用不僅僅是支持和營養神經元，還參與了神經元發育至神經損傷的各種復雜過程。芍藥苷能抑制星形膠質細胞的活性似與芍藥苷的神經細胞保護作用矛盾。但吳玉梅等［13］研究發現芍藥苷對星形膠質細胞活性有明顯的抑制作用，推測芍藥苷促進神經細胞活性的作用是一種直接的作用，而不是通過膠質細胞間接影響神經細胞。
3.5 阻斷鈉通道，抑制鈉內流，減輕腦缺氧損傷 鈉通道失活，鈉鈣交換障礙，持續鈉向內流是細胞缺氧損傷的主要機制。Zhang GQ等［14］應用膜片鉗技術，研究芍藥苷阻斷小鼠海馬CA1區神經元細胞鈉通道，結果發現，以抑制頻率依賴及濃度依賴鈉通道方式，0.3 mmol/L芍藥苷把最大激活電位從-40mV提高到-30mV，增大穩態激活曲線及失活曲線，鈉通道從失活態恢復的時間從（4.2±0.7）ms延遲到（9.8±1.2） ms。說明芍藥苷有阻斷腦海馬CA1區細胞鈉通道的作用。這可能是芍藥苷保護腦缺氧細胞損傷的機制之一。
3.6 對大腦海馬CA1區損害的保護作用 Tsuda T等［15］在鈷致大鼠癲癇模型上研究芍藥提取物對大腦海馬CA1區損害的保護作用，連續30 d給大鼠1 g/kg/d灌胃后，應用鈷造成大鼠癲癇模型，可觀察到大腦皮層頻發棘波及大腦海馬CA1區損害能被芍藥提取物防護，單用芍藥苷或天然鞣酸沒發現類似作用，但聯用兩者有防護作用。
3.7 對細胞鈣超載損傷的保護作用 楊軍等［16］探討芍藥苷對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤克隆株PC12細胞鈣超載損傷模型的保護作用及其機制，采用組織培養法，制備氧化鉀及N-甲基-D-門冬氨酸誘導的鈣超載損傷模型，結果形態學檢查發現芍藥苷對兩種不同類型的鈣超載損傷模型中PC12細胞均具有明顯保護作用，MTT法活細胞測定提示芍藥苷可顯著提高損傷模型中PC12細胞存活數，減少胞內乳酸脫氫酶滲漏，并顯著減少細胞內鈣離子濃度，說明芍藥苷對鈣超載所致PC12細胞損傷有顯著的保護作用，其作用機制可能與抑制鈣離子內流有關。另研究表明［17］，芍藥苷對咖啡因型、氯化鉀型、N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)型細胞內超載損傷均具有保護作用，且隨著濃度的增加，芍藥苷保護作用更加明顯，強度依次為氯化鉀、咖啡因型和NMDA型。芍藥苷也能抑制藜蘆堿誘導的大鼠心房收縮和心律失常。這些均顯示它可能具有鈣通道阻斷作用［18］。
4 對小鼠學習記憶能力的改善作用
孫蓉等［19］觀察芍藥苷對東莨菪堿致小鼠記憶形成障礙、亞硝酸鈉致記憶鞏固障礙和乙醇致記憶再現障礙的影響。采用小鼠跳臺法和Y一型迷宮法， 結果發現芍藥苷對小鼠學習記憶功能有明顯的促進作用，對東莨菪堿致小鼠記憶形成障礙、亞硝酸鈉致記憶鞏固障礙和乙醇致記憶再現障礙有明顯的改善作用，且呈一定的量效關系，說明芍藥苷對東莨菪堿、亞硝酸鈉和乙醇致小鼠記憶獲得、鞏固及再現障礙均有不同程度的改善作用。
Tabata K［20］研究芍藥苷對腺苷A1受體介導記憶障礙的作用，對小鼠訓練實驗后24 h應用選擇性腺苷A1受體激動劑能引起記憶行為損害，腹膜注射芍藥苷及腺苷A1受體拮抗劑DPCPX能減輕這種損害，體外實驗顯示腺苷能劑量依賴性地降低棘波振幅及減少大腦海馬的長時程增強(LTP)的強直刺激，DPCPX能拮抗腺苷的這些作用，而單用DPCPX則對棘波振幅及LTP沒有影響；芍藥苷能拮抗腺苷的減少大腦海馬的長時程增強(LTP)的強直刺激作用，而不能拮抗腺苷的降低棘波振幅作用；結果說明芍藥苷能改善腺苷A1受體介導的認知、記憶障礙。
Tabata K等［21］還通過記錄大鼠腦海馬CA1區的群峰電位，M1、M2受體拮抗劑東莨菪堿和選擇性M1受體拮抗劑哌吡卓酮均能抑制群峰電位的長時程增強，而M2受體拮抗劑AF-DX116則不能，單用芍藥苷不能起抑制作用，但能對抗東莨菪堿和哌吡卓酮的抑制作用，結果說明芍藥苷對抗M1受體拮抗劑的作用可能是芍藥苷改善因膽堿能功能障礙引起的空間認知缺損的機制。
5 誘導熱休克蛋白生成
熱休克蛋白是一種分子伴侶，其功能由幫助蛋白質正確折疊、移位、維持和降解，具有調節蛋白功能及抗蛋白質毒性作用，有對細胞的結構維持、更新、修復、免疫等有重要作用。機體應激時誘生熱休克蛋白，在分子水平上對機體保護作用。Yan D等［22］研究發現而芍藥苷不但能加強誘導熱休克蛋白，也可直接誘導熱休克蛋白;應用芍藥苷處理細胞能加強熱休克基因轉錄因子磷酸化及結合脫氧核糖核苷酸的能力，提示芍藥苷誘導熱休克蛋白的機制是活化熱休克基因轉錄因子，即使高劑量也未見產生毒性作用。
6 舒張動脈血管
Tsai HY等［23］發現單用芍藥苷對離體大鼠大動脈沒有作用，但能減輕藜蘆堿的收縮動脈作用，尤其是對有內皮組織的大動脈，應用藜蘆堿預處理能增強新福林和去甲腎上腺素的收縮動脈作用，去甲腎上腺素介導的藜蘆堿收縮動脈作用的舒張與NO及cGMP的增加有關，藜蘆堿收縮動脈作用是通過增加細胞內鈣引起，而芍藥苷可抑制細胞內鈣的增加，因此有減輕藜蘆堿的收縮動脈作用。
7 抗血栓形成作用
Ye J等［24］在光化學反應微血管血栓形成模型上觀察到芍藥苷有抗血栓形成作用，芍藥苷能延長凝血時間；其機制可能與芍藥苷抑制花生四烯酸代謝，增強組織型纖維蛋白溶煤原活化劑活性，以及對抗氧自由基的作用。
8 結語
綜上所述，芍藥苷是芍藥的主要有效成分，在體內能通過血腦屏障， 對腦缺血-再灌注損傷有保護作用。通過抑制細胞凋亡、 活化腺苷A1受體、阻斷鈉通道，抑制鈉內流、減輕細胞鈣超載損傷等作用機制發揮保護神經細胞作用。還有抗血栓形成、誘導熱休克蛋白生成、舒張動脈血管及鎮痛作用。也能改善小鼠學習記憶能力。目前，有關芍藥苷的神經保護作用研究僅限于動物實驗，具體機理還不太清楚，有待進一步深入研究。
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【摘要】 目的 探索結腸癌colo205細胞系對exosomes的分泌功能，并分析熱休克作用對表面蛋白CD44v6表達量的影響。方法 采用超速離心法分離colo205細胞分泌的exosomes和熱休克處理后colo205細胞分泌的exosomes(Heat shocked exosomes，HSExo)，經220 nm微孔濾膜過濾純化后，在透射電鏡下觀察其形態，并用SDSPAGE方法分析細胞與exosomes的蛋白組成，Western Blot檢測表面CD44v6的表達情況。結果 經透射電鏡觀察，正常exosomes與HSExo形態基本相似，均為圓形或橢圓形膜性囊泡，直徑大多在30～100 nm之間，且經熱休克處理的colo205細胞及其分泌的HSExo，在CD44v6表達量上較正常colo205細胞及exosomes顯著上調(P
【關鍵詞】 結腸癌;exosomes;CD44v6;腫瘤免疫
外脂體是由細胞多囊體形成的一種膜性小囊泡，其來源十分廣泛，其特異功能與來源細胞密切相關：外脂體攜帶著許多種獨特的蛋白，如黏附蛋白，熱休克蛋白等，在信號傳導中起重要作用。作為一種免疫治療的新手段，外脂體可以應用于腫瘤治療。CD44v6是CD44 的一種拼接變異體，其表達可改變腫瘤細胞表面細胞黏附分子的構成和功能，有助于腫瘤細胞獲得轉移潛能，起到介導細胞間黏附、參與信號傳遞等作用，并與腫瘤的預后密切相關。目前，結腸癌外脂體腫瘤疫苗的研究才剛剛起步，主要是從LoVo、LS174T等細胞系中分離外脂體〔1，2〕，對其腫瘤免疫功能有較多的研究，但對結腸癌細胞分泌的外脂體表面相關蛋白的研究相對較少，尤其對其表面CD44v6的檢測至今在國內外未見報道。因此，本課題組擬采用超速離心法從結腸癌細胞系中分離外脂體，對其表面分子CD44v6的表達水平進行檢測，并分析熱休克作用對CD44v6表達量的影響，為結腸癌亞細胞疫苗的研究及應用提供一定的理論依據。
1 資料與方法
1.1 材料 RPMI1640培養基、胎牛血清均購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、對鈉十二烷基硫酸鹽(SDS)均購自美國Sigma公司，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、預染蛋白Marker、均購自北京鼎國生物技術有限責任公司，硝酸纖維素轉印膜購自美國PALL公司，鼠抗人CD44v6單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HPR)標記山羊抗小鼠IgG均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、超敏化學發光(ECL)試劑盒購自碧云天生物技術研究所，人結腸癌colo205細胞株由吉林大學藥學院生物工程實驗中心提供。JEM2000EX透射電子顯微鏡購自日本電子公司、OptimaTM LE80K 低溫超速離心機購自美國Beckman Coulter公司，Olympus IX70倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。
1.2 結腸癌細胞的培養和熱休克處理 實驗選用結腸癌Colo205細胞株，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液于37℃、5% CO2條件下進行常規原代培養，待細胞長滿培養瓶底80%后，擬提取exosomes，將培養細胞用不含小牛血清的RPMI1640洗滌2次，并繼續培養48 h，臺酚藍染色檢測細胞活力(細胞活力應大于97%)。此后，細胞于43℃孵育2 h，再于37℃恢復4 h〔3〕，倒置顯微鏡下觀察細胞狀態變化。
1.3 熱休克源性exosomes(Heat shocked exosomes，HSExo)和非熱休克源性exosomes的提取及純化〔4，5〕 收集結腸癌細胞培養上清液，依次經300 r/min離心5 min、1 200 r/min離心20 min和6 000 r/min離心30 min，去除上清液中的細胞碎片等顆粒后，再以100 000 r/min離心60 min，收集沉淀，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1次。棄上清液，加入20 μl PBS重懸沉淀即為exosomes。-80℃凍存備用，使用前用0.22 μm濾膜過濾純化。
1.4 電鏡觀察分析 取5 μl exosomes和HSExo，滴于載樣銅網上，濾紙吸干液體，在滴加2%磷鎢酸染液，負染1 min，待白熾燈烤干后約10 min，用透射電鏡觀察并照相。
1.5 結腸癌細胞及exosomes表面蛋白的分離 取經熱休克處理和未處理的結腸癌細胞和相應的exosomes，分別放入細胞裂解液中，與冰上放置1 h，制得溶解物〔1〕。于100℃處理10 min，進行蛋白質變性，用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度。
1.6 Exosomes表面蛋白CD44v6的檢測 設正常colo205細胞組、熱休克處理的細胞組、正常外脂體組和熱休克外脂體組，各組設3個復孔，經蛋白濃度檢測后，各組以等量蛋白上樣，進行8% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。電泳后將凝膠中的蛋白質通過濕法電轉移方法，轉移到硝酸纖維素膜上，并用含5%脫脂牛奶的Tris緩沖鹽溶液(TBS)封閉硝酸纖維素膜，37℃作用3 h，將鼠抗人CD44v6單抗用含5%脫脂牛奶的TBS以1∶1 000稀釋，膜與一抗置于封閉塑料袋內，4℃過夜。用TBS洗膜3次，再與辣根過氧化酶標記的羊抗鼠IgG 37℃下結合1 h，用TBS充分洗膜3次，經ECL化學發光試劑作用顯色后，于暗盒內曝光，X光片顯影定影后分析實驗結果。
1.7 統計學分析 用Quantity one v4.62圖像分析軟件進行分析，結果以x±s表示，組內采用t檢驗。
2 結 果
2.1 熱休克colo205細胞的觀察 未經熱休克處理的colo205細胞大多處于貼壁生長狀態，少量懸浮生長;熱休克處理之后懸浮細胞明顯增多，但鏡下未見形態學改變，見圖1。圖1 正常和熱休克處理的colo205細胞(×200)
2.2 結腸癌colo205細胞源exosomes和HSexo的電鏡觀察 透射電鏡下可見exosomes和HSexo大小不一，直徑基本在30～100 nm之間，個別較大，二者形態基本相似，無明顯差別，均為圓形或橢圓形膜性囊泡，并且在局部有相互聚集的傾向，見圖2。
2.3 SDSPAGE結果 從SDSPAGE結果可見，在220 kD與105 kD之間，各樣品組均在一定位置出現條帶，但兩個細胞組與兩個exosomes組的條帶位置有較大差異，而針對細胞組和exosomes組的組內比較條帶位置差異并不顯著。CD44v6的分子量約為190 kD，電泳結果顯示在此區域有蛋白條帶存在(1組為正常colo205細胞，2組為熱休克colo205細胞，3組為正常外脂體，4組為熱休克外脂體)。見圖3。圖2 exosomes和HSExo陽性圖片(×100 000)圖3 SDSPAGE結果
2.4 Western印跡結果分析 正常colo205細胞、熱休克處理的細胞、exosomes和HSexo 4組經顯影定影后均可見清洗條帶。見圖4。用Quantity one v4.62圖像分析軟件對Western印跡結果進行分析，結果顯示經熱休克處理后，CD44v6在細胞及exosomes上均出現了表達上調的現象(P
3 討 論
腫瘤來源的exosomes(Tumor Exosomes，TEX)，在形態學、密度以及一些膜標志物的表達上與抗原提成細胞(APCs)來源的exosomes相似〔5〕。TEX中存在腫瘤抗原運載系統以及與細胞靶向性有關的蛋白(CD9)，這表明exosomes是一種抗原傳遞系統，能將腫瘤抗原轉移到APCs。另外，TEX中含有許多腫瘤細胞所共有的共同抗原，TEX能將其轉移到DC，導致交叉性呈遞的CTL反應〔6〕。熱休克反應是機體受到高溫、缺氧、重金屬離子、紫外線照射等理化因素的作用后，所產生的一種保護機體免受損傷的應激反應。熱休克蛋白是在熱休克反應作用下，啟動熱休克蛋白基因選擇性合成的一組高度保守的蛋白質分子家族。近年來研究發現，人類腫瘤細胞中存在熱休克反應，與腫瘤的生長、增殖及凋亡密切相關，表明熱休克處理結腸癌細胞的方法，使細胞某些蛋白的表達上調，TEX中相應的蛋白含量也隨之增加〔1〕;另外，熱休克處理可以在一定程度上提高TEX的產量〔7〕。在本實驗中，CD44v6表達上調的現象與相關研究一致，但并未發現熱休克作用可提高結腸癌源TEX的產量，所以認為：不同細胞系的熱休克反應往往有所區別，作用方式的差異常導致作用結果不盡一致，熱休克處理不一定提高每種細胞系exosomes的產量。熱休克作用會對exosomes產生影響，但作用機制還需進一步探索與研究。
參考文獻
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