時間：2023-05-30 08:54:50
開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇蛋白酶體，希望這些內容能成為您創作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進步。
［摘要］ 蛋白酶體抑制劑是一類通過對泛素化通路阻斷的一類新抗腫瘤藥物，對腫瘤治療具有良好的應用前景。蛋白酶體是廣泛分布于真核細胞質和細胞核中，具有多種功能的蛋白酶復合物，而泛素―蛋白酶體系統是生物體內進行蛋白質選擇性降解的重要途徑之一，這些蛋白包括轉錄因子、腫瘤抑制蛋白、原癌基因等。體外試驗和動物模型實驗中已顯示蛋白酶體抑制劑具有廣泛抗腫瘤作用，早期臨床試驗也為蛋白酶體抑制劑進一步臨床應用提供了依據。
［關鍵詞］ 蛋白酶體抑制劑；癌癥；治療
泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin proteasome pathway，UPP）是細胞質和細胞核內依賴ATP不同于溶酶體途徑的蛋白質降解通路，80%以上的細胞內蛋白質，包括調節細胞周期的多種蛋白的降解均由此途徑完成。其成分的改變將引起蛋白降解異常，導致細胞功能紊亂。因此蛋白酶體可成為腫瘤治療的靶點，其抑制劑代表了一類全新的分子靶向抗腫瘤藥物。
1 蛋白酶體的結構與功能
1.1 蛋白酶體的結構 蛋白酶體存在于所有真核細胞的胞質及核內，是高度保守具有多種催化功能的蛋白酶復合物［1］。26 S蛋白酶體包括1個20 S的催化單位和2個19 S的調節單位，20 S 蛋白酶體呈桶狀外形，由內層2 個β環和外層2 個α環組成，每個環含有7 個亞基。α亞單位促使底物移位進入中央孔隙水解中心，并使20 S復合體和19 S調節復合體之間發生構象改變；β亞單位N 末端蘇氨酸殘基是蛋白酶體的水解中心，β1、β2、β5亞單位分別具有半胱氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶樣活性［1，2］。
1.2 蛋白酶體生物學功能 泛素的靶蛋白包括:細胞周期、調節因子、腫瘤抑制因子、轉錄激活因子和抑制因子、細胞表面受體，如：細胞周期素及其依賴性激酶抑制劑（P19，P21，P27，P57）;腫瘤抑制因子（P53，Rb）;原癌基因（c-myc，c-fos and c-jun）;促凋亡分子（Bax，MDM2 and IAPs）；轉錄因子（E2A，E2F and STAT）；NF-κB 及其抑制因子Ⅰ－κB 等。Ⅰ－κB 能裂解胞漿中NF-κB 的p50/p65 異二聚體，使NF-κB 介導的轉錄被阻止，細胞應激反應（包括化療和放療） 可減輕這種抑制，引起ⅠκB 的降解:Ⅰ－κB 的N 端特殊的絲氨酸殘基磷酸化，促進內部賴氨酸殘基泛素反應;泛素化的Ⅰ－κB 被蛋白酶體識別和降解，NF-κB 釋放，易位進入核內與DNA結合激活細胞增殖、分化、抗凋亡等多種基因轉錄。因此抑制NF-κB 活性是逆轉化療耐藥關鍵因素，可以增加腫瘤細胞對化療、放療的敏感性。蛋白酶體抑制劑可以穩定Ⅰ－κB，抑制其被磷酸化降解，而阻止NF-κB 激活，發揮抗腫瘤作用［3，4］。
2 蛋白酶體抑制劑
乳胞素是鏈霉菌屬的天然代謝物，其活性中間體的β-內酯可選擇性但不可逆地結合于蛋白酶體的β5（糜蛋白活性）亞單位。抑制糜凝乳蛋白酶樣活性最快，而胰蛋白酶樣和肽基谷氨酰肽水解酶活性被抑制較慢，絲氨酸和酪氨酸蛋白酶活性不受抑制。隨著X線結晶照相術應用于分析蛋白酶體結構，許多高選擇性、活性更強可逆蛋白酶體抑制劑被合成，包括醛基肽PSI、MG132，可逆抑制蛋白酶體β2、β5亞單位。同時，也可抑制鈣蛋白酶與組織蛋白酶B。由于其特定的結構決定了其代謝不穩定性，其在體內的應用時特異性較差，生物利用度也不高。新一代合成的蛋白酶體抑制劑（包括MG262，硼替佐米），能夠與蛋白酶體活性中心蘇氨酸殘基穩定結合，這種結合方式也是可逆的。硼替佐米較醛基肽相比其對糜蛋白酶高度敏感，效率也在1000倍以上，并具有高度的選擇性。
3 蛋白酶體抑制劑臨床前研究
美國國立癌癥研究所首次證明硼替佐米抑制前列腺癌PC-3細胞株生長，引起細胞凋亡是通過穩定p21，將細胞阻滯于G2/M期及PARP的清除［5］。此外，聯合硼替佐米可增加化療或放射治療對結腸癌異基因移植的治療效果。在這些研究中，都能證明蛋白酶體靶點包括p21，ⅠκB 和NF-κB［6］。在體內動物模型研究中硼替佐米對腫瘤有明顯抑制作用，在腦、直腸、肝、骨骼肌、前列腺及中藥代動力學顯示了較好的耐受力。進一步體內、體外試驗證明了蛋白酶體抑制劑對多種腫瘤細胞具有促凋亡作用，包括小細胞肺癌、鱗狀細胞癌、胰腺癌、卵巢癌、間皮瘤、人細胞膠質瘤、成人B細胞、T細胞白血病。硼替佐米可以顯著上調非小細胞肺癌NCL-H520、NCL-H460細胞株p21和p53表達水平，同時下調BCL-2蛋白水平，抑制這兩株細胞生長，促進其凋亡。同時使c-jun氨基端激酶和c-jun磷酸化，增強激活蛋白AP-1與DNA的結合。用JNK抑制劑SP600125阻斷JNK/c－jun/AP-1通路，p21表達水平不再有變化，而p53表達仍然上調。因此JNK/c－jun/AP-1通路在硼替佐米誘導凋亡途徑中期有重要作用［7］。硼替佐米可與其他分子靶向藥物聯用，ErbB2高表達的人乳腺癌細胞SKBR3對trastuzumab（曲妥單抗）抵抗，聯合應用硼替佐米可以增強其療效，其機制在于硼替佐米增加PTEN （phosphatase and tension homolog deleted on chromosome）表達相關。PTEN基因表達產物與抑制磷脂酰肌醇-3-激酶PI3K/Akt通路相關。腫瘤組織PTEN低表達與trastuzumab化學敏感性較差相關［8］。最新合成的蛋白酶體抑制劑NPI-0052結構和作用機制與硼替佐米完全不同，但對蛋白酶體胰蛋白酶、糜蛋白樣活性抑制作用更強［9］。NPI-0052誘導淋巴瘤細胞凋亡機制在于使線粒體膜去電勢，細胞色素C等超氧化物酶釋放，激活caspase-8/9/3等。NPI-0052對正常淋巴細胞毒性更低，可口服給藥，與硼替佐米聯合應用，可減低藥物毒性，克服硼替佐米耐藥，提高療效［10］。NPI-0052也即將進入Ⅰ期臨床研究。
4 蛋白酶體抑制劑臨床試驗研究
4.1 蛋白酶體抑制劑單藥臨床試驗 在幾項血液惡性腫瘤和實體瘤（前列腺癌，非小細胞肺癌）臨床研究中，硼替佐米最大耐受劑量（MTD）在1.04～1.06 mg/kg之間，常見限制性毒性（DLT）有低血壓，暈厥，腹瀉，疲乏，周圍神經病變，電解質紊亂，血小板減少。根據Ⅰ期臨床試驗結果，進行了一個多中心開放、非隨機的Ⅱ期臨床試驗，202例復發性/難治性多發性骨髓瘤患者參加了試驗，患者以前至少接受過3種治療，患者接受硼替佐米1.3 mg/kg靜脈bolous給藥，每2周2次后休息1周，此為1個周期，共8個周期。共有27.7%的患者獲得完全緩解或部分緩解，首次中位反應時間為1.3個月，整個中位反應期為12個月，202例患者中位生存期為16個月。3級以上的不良事件包括:血小板減少（28%）、疲勞（12%）、周圍神經病變（11%）［11］。首個Ⅲ期臨床試驗研究在669例復發性/難治性多發性骨髓瘤患者中進行了硼替佐米和地塞米松單藥治療的療效比較。硼替佐米和地塞米松組的4級毒性反應發生率、嚴重不良反應和治療相關死亡率基本相似，并且都能持續使用。研究結果顯示，與地塞米松相比，硼替佐米具有更高的有效率（分別為38% 對18%，包括PR、nCR和CR）、TTP（6.2個月對3.5個月）和生存時間（1年為80%對66%）。以硼替佐米作為二線治療的患者，在TTP及總生存率方面獲益最大［12］。進一步神經內分泌腫瘤，腎癌和乳腺癌Ⅱ期臨床試驗僅有少量證據證明硼替佐米單藥使用時有相關臨床作用［13～15］。其他的一些臨床Ⅱ期試驗正在進行中，包括：難治性結腸癌，進展性非小細胞肺癌，復發或進展期非霍奇金淋巴瘤等。
4.2 蛋白酶體抑制劑與其他化療藥物聯用
許多化療藥物可以誘導NF-κB，從而激活腫瘤細胞的抗凋亡程序。而蛋白酶體抑制劑可阻斷放化療對NF-κB的激活，還可直接誘導BCL-2的磷酸化及剪切、抑制P-糖蛋白的成熟、抑制細胞的DNA損傷修復等途徑，增強某些化療藥物的治療效果。這些決定了蛋白酶體抑制劑不但可以單獨用于抗腫瘤治療，而且可以和其他的化療藥物聯合應用。硼替佐米治療復發/難治性多發性骨髓瘤的兩項Ⅱ期臨床研究結果表明，處于疾病進展期或四程化療后仍處于平臺期的患者，可以在硼替佐米的基礎上加用地塞米松單藥有效率分別為30％和38％，加用地塞米松后分別為37％和50％［16］。Berenson JR治療了34例骨髓瘤患者，于 1、4、8、11、28天給予患者硼替佐米靜脈注射，美法侖從1～4天口服。硼替佐米和美法侖MTD分別為1.0 mg/m2，0.1 mg/kg，有效率（最小/部分/完全反應）為68％，其中2例獲得完全緩解，11例部分緩解，中位疾病進展時間8個月［17］。在一些實體瘤中硼替佐米也有應用，卡鉑聯用硼替佐米被用來治療復發卵巢癌，在這個I期臨床試驗中觀察了最大耐受劑量、藥效動力學、安全性。硼替佐米最大耐受劑量為1.5 mg/m2，卡鉑對硼替佐米藥效動力學沒有影響，硼替佐米可以抑制卡鉑對NF-κB的激活。主要毒性有腹瀉，皮疹，神經毒性，便秘，減少藥物劑量后癥狀都可控制。15例病例有效率為47％，包括2例完全緩解，5例部分緩解，建議Ⅱ期臨床試驗時硼替佐米劑量為1.3 mg/m2［18］。36位進展期實體瘤患者（26位為非小細胞肺癌）接受多西紫杉醇（d1）與硼替佐米（d1，4，8，11）治療，3周為1個周期。多西紫杉醇/硼替佐米最大耐受劑量分別為75/1.0 mg/m2，患者能夠較好地耐受，最常見的副反應有腹瀉，疲乏，惡心，周圍神經病變。2例患者獲得部分緩解，7例患者病情保持穩定［19］。
蛋白酶體抑制劑有望成為治療癌癥的新途徑，它能克服傳統抗癌藥物的耐受性，表現出了潛在的抗腫瘤活性，臨床研究又提供了令人鼓舞的試驗數據。隨著蛋白酶體抑制劑抗腫瘤作用機制進一步被闡明，這必將為腫瘤治療提供新的臨床思路。
［參考文獻］
1 Tanaka K，Yoshimura T，Kumatori A，et al.Proteasomes （multiprotease complexes） as 20S ringshaped particles in a variety of eukaryotic cells.J Biol Chem，1988，263:16209-16217.
2 Adams J，Behnke M，Chen S，et al.Potent and selective inhibitors of the proteasome:dipeptidyl boronic acids.Bioorg Med Chem Lett，1998，8:3333-3338.
3 Baldwin AS.Control of oncogenesis and cancer therapy resistance by the transcription factor NFκB.J Clin Invest，2001，107（3）:241-246.
4 Adams J.Proteasome inhibition:a novel approach to cancer therapy.Trends Mol Med，2002，8 （4）:S49-S54.
5 Adams J，Palombella VJ，Sausville EA，et al.Proteasome inhibitors:a novel class of potent and effective antitumor agents.Cancer Res，1999，59:2615-2622.
6 Shah SA，Potter MW，Mcdade TP，et al.26S proteasome inhibition induces apoptosis and limits growth of human pancreatic cancer.J Cell Biochem，2001，82 （1）:110-112.
7 Yang Y，Takeyuki I，Tsuyako S，et al.Proteasome inhibitor PS341 induces growth arrest and apoptosis of nonsmall cell lung cancer cells via the JNK/cJun/AP1 signaling.Cancer Sci，2004，95:176-180.
8 Fujita T，Doihara H，Washio K，et al.Proteasome inhibitor bortezomib increases PTEN expression and enhances trastuzumabinduced growth inhibition in trastuzumabresistant cells.AntiCancer Drugs，2006，17（4）:455-462.
9 Chauhan D，Chao T，Catley L，et al.In vitro and in vivo proteasome activity profiles of bortezomib and a novel proteasome inhibitor NPI-0052.Blood，2005，106.
10 Chauhan D，Li G，Podar K，et al.A novel orally available proteasome inhibitor NPI-0052 induces killing in multiple myeloma （MM） cells resistant to conventional and bortezomib therapies.Blood，2004，104.
11 Richardson PG，Barlogie B，Berenson J，et al.A phase 2 study of bortezomib in relapsed，refractory myeloma.N Engl J Med，2003，348:2609-2617.
12 Orlowski，Robert Z.Is bortezomib superior to highdose dexamethasone for the treatment of relapsed multiple myeloma? Nature Clinical Practice Oncology，2006，3（1）:16-17.
13 Shah MH，Young D，Kindler HL，et al.Phase Ⅱ study of the proteasome inhibitor bortezomib （PS-341） in patients with metastatic neuroendocrine tumors.Clin Cancer Res，2004，10:6111-6118.
14 Davis NB，Taber DA，Ansari RH，et al.Phase Ⅱ trial of PS-341 in patients with renal cell cancer:a University of Chicago phase Ⅱ consortium study.J Clin Oncol，2004，22:115-119.
15 Yang CH，GonzalezAngulo AM，Reuben JM，et al.Bortezomib （VELCADE（R）） in metastatic breast cancer:pharmacodynamics，biological effects，and prediction of clinical benefits.Annals of Oncology，2006，17（5）:813-817.
16 Jagannath S，Barlogie B，Berenson J，et al.A phase 2 study of two doses of bortezomib in relapsed or refractory myeloma.Br J Haematol，2004，127:165-172.
17 Berenson JR，Yang HH，Sadler K，et al.Phase I/Ⅱ trial assessing bortezomib and melphalan combination therapy for the treatment of patients with relapsed or refractory multiple myeloma.Journal of Clinical Oncology，2006，24（6）:937-944.
26S 蛋白酶體是存在于真核生物中的一種高度保守且依賴 ATP 的復合酶。26S 蛋白酶體能夠快速精確地降解目的蛋白，在幾乎所有生命活動中都發揮重要作用，如細胞周期、細胞凋亡、DNA 損傷修復、免疫應答、信號轉導及細胞代謝等[1]。26S蛋白酶體由 20S 核心復合物 (core particle，CP) 和 19S 調節復合物 (regulatoryparticle，RP)組成。20S 核心復合物約 700 kD，呈圓筒形，由外部的兩個 α 環和內部的兩個β環組成，主要負責蛋白質的降解。在低等生物 (如古細菌) 中，20S 核心復合物由 14個相同的α亞基和14 個相同的 β 亞基組成。在真核生物中，20S 的 α 環和 β 環分別由 7 個亞基構成。α 環和 β 環在結構上是類似的[2]，α環形成軸向門控通道，β環形成降解腔。β亞基的活性位點均位于環的內側。β1、β2 和 β5 亞基具有水解功能，能夠切割酸性殘基、堿性殘基或者疏水殘基C 端肽鍵[3～5]。19S 調節復合物位于 20S 核心復合物的一側或者兩側，由 19 個不同的亞基組成，可分為 ATPase 類亞基 Rpt (regulatory particle triple-A protein，Rpt1～6) 和非 ATPase 類亞基Rpn (regulatory particle non-ATPase protein，Rpn1～13) 兩大類，共同組成了蓋子和基底兩部分[6]。基底由 6 個 Rpt 亞基 (Rpt1～6) 和 3 個 Rpn 亞基 (Rpn1、Rpn2、Rpn13) 組成。ATPase亞基介導底物的去折疊和 α 環的打開，以利于底物最終被 20S 核心復合物降解。Rpn1、Rpn13、Rpn10 和 Rpt5 負責捕獲泛素化修飾的蛋白或是含有 UBL ( ubiquitin-likedomain)或UBA (ubiquitin-associated domain)結構域的蛋白[7]。蓋子由 Rpn3,5～9,11,12,15組成，可將已捕獲的蛋白去泛素化，從而進入降解腔，完成蛋白質的降解[8]。基底的ATPase 類亞基 (Rpt1～6) 形成異源六聚圓環，與 20S 核心復合物的 α 環相連[9]，而Rpn10負責連接蓋子和基底。19S 調節復合物能夠識別多泛素化修飾的底物蛋白質，而后通過一系列的去泛素化、去折疊過程將其運送到降解腔，最終實現蛋白質的降解，這些過程均需要ATP的參與[10]。
真核生物20S核心復合物組裝的分子機制
20S核心復合物可以單獨存在或與 19S 調節復合物組成 26S 蛋白酶體，其組裝過程不需要 19S 調節復合物的參與。在酵母[11]和哺乳動物[12]中，20S 的結構都是相同的，其組裝過程也是高度保守的。20S核心復合物是由 4 個七亞基環垛疊而成的圓筒狀結構，排布的順序為α1-7β1-7β1-7α1-7，每一個亞基的站位都是固定的，此規律性排布模式受到嚴格的調控。
α環的組裝
20S核心復合物的組裝始于α環的組裝。在人源細胞中，為保證 7 個亞基具有固定的排布次序，復合體PAC1 (proteasome assembling chaperone 1) -PAC2在其中發揮關鍵的作用[13]。PAC1-PAC2 復合體與 α5 和 α7 直接相連，且連接方式與 PAC3-PAC4 和 α 環的連接方式相反[14]。研究發現，缺失 PAC1 或 PAC2 會導致 α 環的正常組裝率下降，錯誤裝配的α環增多；而且，缺失其中一個分子會引起另一個分子的表達缺失。因此，PAC1-PAC2 必須形成異源二聚體才能行使維持并監控α環準確組裝的作用[15]。在 α 環組裝過程中，PAC1-PAC2與 20S 核心復合物的前體相連，待 20S 核心復合物組裝完成以后，PAC1-PAC2被已形成的20S 核心復合物降解，其壽命較短，半衰期約為 30～40 min[13,15]。然而，目前關于 PAC1-PAC2 在 20S 核心復合物中的定位依然存在爭議。有報道表明，如果此復合于20S的表面，那么它可以保護 20S 的入口[16]。小分子PAC3 和 PAC4 在 20S 組裝過程中也發揮重要作用。相對于 PAC1-PAC2，PAC3壽命較長，在20S 組裝完成之前即離開 α 環。PAC3、PAC4 可以形成異源二聚體[17]，通過校正α亞基的排布來抑制α亞基之間的錯誤連接。酵母中，PAC1、PAC2、PAC3 和 PAC4分別對應于 Pba1 (proteasome biogenesis-associated 1；also known as Poc1)、Pba2 (alsoknown as Add66 and Poc2)、Pba3 (also known as Poc3，Dmp2 and Irc25)和Pba4 (alsoknown as Poc4 and Dmp1)。在酵母中，當α環組裝時，Pba3 與 Pba4、α5 形成三元復合物，從而募集周圍的α亞基。當 β2 進入到 20S 的組裝中時，Pba3 與 Pba4 離開 α 環[18]。研究發現，在酵母細胞中，Pba3 或 Pba4 表達的缺失，會導致 α 環和 20S 的含量降低，并且伴隨中間組裝體的聚集。在缺失 Pba4 的細胞中，出現了含有兩個 α4 亞基而缺失 α3 亞基的新型蛋白酶體形式[19]，且這種蛋白酶體具有抵抗重金屬壓力的特點。然而，在哺乳動物細胞中是否也存在類似現象，還有待進一步深入研究。
β環的組裝
α環在β環的組裝中發揮支架作用。β環的組裝以β2開始，然后依次是β3、β4、β5、β6和β1，最后是β7[20]。在酵母和哺乳動物中均能檢測到含有 β2、β3、β4 與 α 環的組裝中間過渡體13S 復合物，表明 β 亞基定位于 α 環上[21]。當最后進入 β 環的 β7 亞基組裝完成后 ，20S 核 心 復 合 物 即 已 經 組 裝 了 一 半 ， 稱 為 15S 復 合 物 ， 又 叫 半 蛋 白 酶 體( half-proteasome)[22]， 其 包 括α1 ～7、 β1 ～7、 Ump1 ( ubiquitin maturation protein1)和PAC1-PAC2[20]。人類細胞中，PAC3 在體外可直接結合 β3，β3 可能通過與 PAC3 短暫的相互作用結合到組裝中間體，PAC3 的釋放介導了 β3 的組裝[23]。Ump1是第一個鑒定到的β環組裝蛋白酶體的分子伴侶，存在于α環和未組裝的β亞基上。在 Ump1 缺失的酵母突變體中，泛素介導的蛋白酶體降解不能發生。Ump1 促進 β3 至 β6 亞基的有序組裝和半蛋白酶體的二聚化，而 Ump1 最終被新合成的 20S 蛋白酶體包裹并降解[24]。在人源細胞中，Ump1敲除后只有α環的聚集，而沒有β環聚集。可見，Ump1 參與整個 β 環的組裝，而不是只參與其中某一進程。此外，β7的羧基端在 20S 核心復合物的最后成熟階段起到獨特的伴侶功能，其羧基端和β1與另一個β環的β2相互作用，啟動半蛋白酶體的二聚化。有研究者在酵母成熟的 20S 核心復合物的晶體結構解析中發現，β7 的羧基端可以延伸到下一個β環上，同時發現β7和β4與另一個β環的β1和β2均有相互作用[17]。由此可見，β 環的正確組裝不僅需要分子伴侶 Ump1、PACs 的輔助[25]，α和β亞基間的相互作用也為20S 核心復合物的形成提供了重要保障。20S 最后是由兩個半蛋白酶體的 β 環連接而成的，其組裝過程如圖 1[14]所示。而蛋白水解活性的成熟就標志著 20S 組裝的完成。
19S調節復合物組裝的分子機制
基底的組裝機制
19S調節復合物的基底由 6 個 ATPase 類亞基 (Rpt1～6) 和 3 個非 ATPase 類亞基組成。6個 ATPase 亞基組成了一個異六聚環與 α 環相連，Rpn1、Rpn2 位于這個 ATPase 亞基環中。在哺乳動物中，P27、P28、S5b 和 Rpn14 開始被認為是蛋白酶體的成員，后來發現它們只是蛋白酶體相互作用蛋白，與 Rpt 亞基的羧基端結合，參與 ATP 六聚環的形成[26～28]。在細胞內，19S 基底部的亞基通常成對存在，只有 Rpn2 可以獨立存在。Rpt3 與 Rpt6 相連，Rpt1和 Rpt2 與 Rpn1 相連，Rpt4 與 Rpt5 相連。P28 和 Rpn14 與 Rpt3-Rpt6 復合體相連，S5b與 Rpt1-Rpt2-Rpn1 復合體相連，且分子伴侶 P28 和 S5b 極大地促進了這兩個復合物的結合。而 P27 抑制 Rpt4-Rpt5 與其他復合體結合。P27 敲除后，P28 復合物與 S5b 復合物不再能結合 Rpt4-Rpt5，從而導致基底正常組裝的障礙。研究發現，基底的組裝起始于 P28-Rpt3-Rpt6-Rpn14，或者是 S5b-Rpt1-Rpt2-Rpn1，待這兩個復合物結合后，P27 就會由抑制結合轉變為促進 Rpt4-Rpt5 與它們的兩復合體結合[29]，進一步表明，在特定分子伴侶的作用下，19S不同亞基可以有序規律組裝。隨后，Rpn2 和 Rpn13 結合到此復合體上，完成基底部分的組裝[30]。最終通過 Rpn10 與蓋子連接形成 19S 調節復合物體，其組裝圖如圖 2[31]。近期在對酵母的研究中發現，Rpt6的羧基端與 P27 和 S5b 的分解有關[30]，介導其在基底形成后從復合物中的解離過程。然而，P28 在 19S 調節復合物徹底成熟后才被解離，提示 P28 可能參與調節20S核心復合物和 19S 調節復合物的結合。分子伴侶在19S 調節復合物的組裝過程中發揮非常重要的作用，但是關于 19S 的形成過程目前還存在一定爭議，近年提出了19S 組裝的另外一種模式。在這種模式中，20S 核心復合物在19S 調節復合物組裝中起到核心作用[32,34]。19S 的亞基 Rpt2、Rpt4、Rpt6 及 Rpt3首先組裝到20S 上，然后間接結合 Hsm3-Rpt1-Rpt2-Rpn1-Rpt5 復合物。Rpn14、Nas2 (P27)和Nas6 (P28)被認為與19S 調節復合物中亞基的羧基端有相互作用，同時，這些伴侶分子還可以保護20S通道的開關[33]。但大家還是普遍認可前一種組裝模式。Rpt亞基組成的異源六聚環，其羧基端均插入到 20S 核心復合物的 α 環中，其中有 4個 Rpt 亞基的羧基端含有 Hb-Y-X 模序，能夠幫助打開 α 環[34]。近年來，研究人員已通過晶體結構方法解析出19S中 Rpt 亞基六聚環各個亞基的排布結構，其模式為 Rpt1-Rpt2-Rpt6-Rpt3-Rpt4-Rpt5[35]。這一發現使我們更為清晰地了解了 19S 調節復合物的組裝情況，并發現了其潛在的中間體，同時也為揭示 19S 調節復合物在組裝過程中的分子伴侶功能提供了結構依據。
蓋子的組裝
20S的β環的組裝必須在α環形成的基礎上進行。與此不同，19S 的蓋子和基底是兩個獨立的組裝過程，最后，它們由Rpn10連接起來。蓋子分為兩個組分，Rpn5、Rpn6、Rpn8、Rpn9 和 Rpn11 構成一組，另一組是由 Rpn3、Rpn7、Rpn12 和 Rpn15 組成。首先是Rpn5-Rpn6-Rpn8-Rpn9形成復合物，與 Rpn11 相互作用形成 Rpn5-Rpn6-Rpn8-Rpn9-Rpn11；Rpn3-Rpn7-Rpn15 復合物與 Rpn12 相互作用形成 Rpn3-Rpn7-Rpn15-Rpn12 復合物[36,37]；然后這兩組通過 Rpn3 和 Rpn5 聯系到一起[38,39]。目前對于 19S 調節復合物組裝的研究還不夠透徹。因為蓋子是一個獨立的組裝過程，所以，蓋子的組裝一定需要分子伴侶的參與。酵母中分子伴侶 Hsp90 的失活促使蓋子復合體裂解[40]，體內重新活化 Hsp90，或者加入 Hsp90和ATP，使蓋子復合物重新裝配進蛋白酶體，因此，Hsp90 被認為是 19S 蓋子組裝及各亞基穩定過程中的重要分子伴侶。Hsp90 在哺乳動物中的具體作用值得深入挖掘。
[關鍵詞] 肺腺癌；蛋白酶體抑制劑；A549細胞；Bcl-2；Bad
[中圖分類號] R734.2；R730.54 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2011）12（a）-032-03
The effect and mechanism on the apoptosis of adenocarcinoma of lung A549 cell treated with MG132
ZHU Yi, GONG Li, NIU Hongyan
Department of Chest Aurgery, the Second People's Hospital of Huai'an City Affiliated of Xuzhou Medical College, Jiangsu Province, Huai'an 223002, China
[Abstract] Objective: To study the apoptosis of adenocarcinoma of lung A549 cell treated with different concentrations of proteasomes inhibitor MG132, and to observe the expression of Bcl-2 and Bad in A549 cells. Methods: In vitro, A549 cells were exposed to 0, 5, 10, 20, 40 μmol/L of MG132. 24 hours later, the survival rate of A549 cells was detected with MTT chromatometry, flow cytometry detected the apoptosis rate of A549 cells, and the expression of Bcl-2 and Bad in A549 cells was measured with Western Blot. Results: MG132 caused the apoptosis of A549 cells in a concentration-dependent manner, the survival rate of cells was gradually decreased while the apoptosis rate of cells was increased after 24 hours exposure to MG132. Meanwhile, the expression of Bcl-2 was decreased, and the Bad expression was unchanged in A549 cells. Conclusion: MG132 could induce A549 cells apoptosis partly through depressing the expression of Bcl-2, but not promoting Bad expression.
[Key words] Adenocarcinoma of lung; Proteasomes inhibitor; A549 cell; Bcl-2; Bad
近幾十年來，肺癌的發病率和死亡率不斷升高。在1998~2002年，肺癌的發病率和死亡率在我國大多數地區居惡性腫瘤的首位[1]；而在2002年肺癌的新病例和死亡人數在全世界也居惡性腫瘤首位[2]。肺癌的病理分型出現腺癌比例增加的趨勢。在生物體內蛋白質進行選擇性降解的重要途徑之一是泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin proteasome pathway，簡稱UPP 通路），它在調節細胞凋亡過程中的作用非常重要[3-4]，在研究UPP在細胞凋亡中的作用時，蛋白酶體抑制劑（MG132）的應用為我們提供了有力的手段。有研究表明，蛋白酶體抑制劑能夠誘導多種人腫瘤細胞的凋亡是通過阻斷泛素化通路而實現，但其具體作用機制到目前仍未被闡明[5-6]。該研究應用體外培養的人肺腺癌細胞株A549，并且給予不同濃度的MG132處理，觀察其對A549細胞凋亡率的影響，以及細胞內Bcl-2和Bad蛋白表達水平的變化。探討MG132調控A549細胞凋亡的可能機制，為進一步研究MG132誘導A549凋亡的機制和其他類型肺癌以及其他腫瘤的作用提供參考。
1 材料與方法
1.1 A549細胞和試劑
人肺腺癌細胞株A549購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所。新生牛血清（NBS，杭州四季青生物工程材料研究所）；RPMI-1640培養基（Gibco公司）；AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒（上海博蘊生物試劑有限公司）；MG132、一抗Bcl-2和Bad、MTT（Sigma公司）。
1.2 細胞培養及處理
將A549細胞常規復蘇后，以RPMI-1640培養液加10%NBS培養，放入37℃、5%CO2的培養箱內培養，細胞傳2~3代后按照需要接種于不同培養板中，當細胞融合密度約70%時，換無血清的RPMI-1640培養液培養，MG132在給藥前應用RPMI-1640培養液現配。并且進一步稀釋使其在培養液中的終濃度為：0、5、10、20、40 μmol/L，并設空白對照組（不做任何處理）。培養24 h，檢測相關指標。
1.3 MTT比色法檢測細胞存活率
細胞按照需要接種于96孔板，處理方法同“1.2”所述，將培養24 h后的每組細胞，每孔中加入MTT 20 μl（PBS配制、5 g/L）。4 h后終止培養，吸棄所有液體，再加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）200 μl充分溶解，靜置于37℃條件下30 min。用酶標儀測定570 nm光密度（OD）值，計算細胞存活率（即每組OD值/正常對照組OD值×100%＝該組的細胞存活率）。
1.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）
將傳代后細胞接種于培養瓶內，處理同方法“1.2”所述。培養24 h后收集細胞，應用胞漿蛋白抽提試劑盒提取蛋白，測蛋白后分裝，保存于-80℃冰箱中備用。將等量蛋白以10%聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，半干轉法至NC膜上，隨后經5%脫脂奶粉封閉，室溫下1 h，加入稀釋的一抗Bcl-2（1∶300）和Bad（1∶300），4℃條件下過夜。第2日晨復溫30 min，常規方法洗膜，NBT/BCIP顯色，雙蒸水洗膜終止反應。應用圖像處理儀（Gene Company）掃描結果，Image J軟件進行半定量分析。
1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率
細胞傳代后接種于6孔板，處理方法同“1.2”所述。培養24 h，吸盡培養基，用胰蛋白酶（0.25%）消化細胞后收集，磷酸鹽緩沖液（PBS）液洗2次，每組細胞收集為1管，每管加入凋亡試劑盒中的結合緩沖液將細胞重懸，隨后將細胞轉移到試管中。每管再分別加入10 μl的PI和5 μl的Annexin V-FITC。避光，室溫放置5 min，流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。
1.6 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，Sigma Plot 2000作圖。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用最小顯著差（LSD-t）法，以P
2 結果
2.1 MG132對A549細胞成活率的影響
MTT法檢測結果顯示，隨著MG132濃度的增加A549細胞存活率逐漸下降（表1），呈現濃度依賴性關系。并且，與正常對照組比較，除了0 μmol/L組外，其余各組差異均有統計學意義（均P＜0.05）。
表1 MG132對A549細胞存活率的影響（n=5）
注：與空白對照組比較，*P＜0.05
2.2 MG132對A549細胞凋亡率的影響
Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測結果顯示，空白對照組A549細胞凋亡率約（4.0±1.4）%，0 μmol/L組凋亡率為（4.1±1.7）%、5 μmol/L組凋亡率為（12.2±2.1）%、10 μmol/L組凋亡率為（26.3±2.9）%、20 μmol/L組凋亡率為（33.1±3.0）%、40 μmol/L組凋亡率為（54.2±4.7）%，與空白對照組比，除0 μmol/L組外，其余各組差異均有統計學意義（均P＜0.05）。
2.3 MG132對A549細胞中Bcl-2和Bad蛋白的影響
Western Blot結果顯示，隨著MG132的濃度增高A549細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達逐漸降低（圖1A），除0 μmol/L組外，其余各組與空白對照組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。而促凋亡蛋白Bad的表達在各組中無明顯變化（圖1B）。與空白對照組比，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。
A代表Bcl-2在各組中的表達，B代表Bad在各組中的表達；與空白對照組比，*P＜0.05，與空白對照組比，#P＞0.05
圖1 Western Blot檢測細胞內Bcl-2和Bad蛋白的表達
3 討論
泛素-蛋白酶體通路[7]（UPP）調控著真核生物細胞內絕大部分蛋白質的降解過程，參與細胞轉錄、蛋白質穩定、蛋白質降解、細胞凋亡、應激反應和受體胞吞等多種生理過程，能夠通過多種途徑影響細胞周期的進行，是真核細胞內重要的蛋白質質控系統。MG132[8]（Z-Leu-Leu-Leu-CHO，三肽基乙醛）可以抑制UPP途徑介導的蛋白質降解，是一種常用的肽醛類26S蛋白酶體抑制劑，如影響NF-κB、調節細胞內凋亡信號通路、調節細胞周期相關蛋白和凋亡調控蛋白等過程，從而抑制細胞的增殖促進細胞凋亡，是很有發展前途的抗腫瘤藥物。也有研究表明：與凋亡調控相關的Bcl-2家族、caspase和凋亡抑制因子等的降解均與UPP有關[9-10]。在本研究中筆者特別關注Bcl-2家族在UPP通路中的作用，在細胞凋亡調控機制方面，Bcl-2是迄今研究最廣泛而深入的凋亡調控基因之一，在細胞凋亡中起著非常重要的作用，Bcl-2能夠抑制細胞凋亡，而Bad則促進細胞的凋亡，是該家族中兩組作用相反的蛋白。本研究應用體外培養的A549人肺腺癌細胞，給予不同濃度蛋白酶體抑制劑MG132處理一段時間后，檢測細胞凋亡率的變化，同時觀察對細胞中Bcl-2和Bad兩種蛋白表達水平的影響，初步探討在A549細胞凋亡中UPP通路的作用及其可能的機制。
該研究結果顯示，隨著MG132濃度增加A549細胞的凋亡率逐漸增加，并且細胞中Bcl-2蛋白的表達水平也逐漸降低。同時在筆者的實驗中也發現，Bad蛋白的表達水平在各組中沒有明顯變化。因此，筆者推測，MG132可能是通過減少Bcl-2蛋白的表達誘導A549細胞凋亡，而Bad蛋白似乎不參與MG132誘導A549細胞凋亡的作用。Pigneux 等[11]發現MG132 能夠明顯地增強一種抗腫瘤藥物（IDA）誘導白血病細胞的凋亡， 而此作用是通過上調促凋亡蛋白Bim和Bax的表達實現。Yan等[12]觀察到MG132 處理的MG-63細胞內除了Caspase-8活性增加、p27聚集外，Bcl-2和Bax比值也明顯增加， 說明Bcl-2家族蛋白之間的比例失衡可能也是MG132誘導細胞凋亡的機制之一。Guzman等[13]發現MG132能夠誘導人白血病細胞的凋亡， 而對正常的白細胞幾乎沒有作用。MG132與目前大多數的抗腫瘤藥物對細胞無選擇性的殺傷作用有明顯的不同，因此筆者設想，蛋白酶體抑制劑的應用為腫瘤的治療提供了新的方向。
然而，對于MG132其抑制腫瘤的作用和機制還有很多需要回答的問題，例如其是否還影響Bcl-2家族中其他成員的表達；是否影響另外兩個與凋亡相關的家族蛋白Caspase家族和凋亡抑制蛋白（IAP）家族成員的表達，以及其與臨床常用的抗腫瘤藥物有何差異等，這些問題還有待于在以后的研究中深入探討。
[參考文獻]
[1] 陳萬青,張思維,李連弟,等.中國部分市縣1998-2002年肺癌的發病與死亡[J].中國腫瘤,2006,15(9):570-574.
[2] Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.
[3] Asams J. The proteasome: structure, function, and role in the cell [J]. Cancer Treatment Reviews,2003,29:3-9.
[4] Podar K, Gouill SL, Zhang J, et al. A pivotal role for Mcl-1 in Bortezomib-induced apoptosis [J]. Oncogene,2008,27(6):721-731.
[5] 張衛國,吳清明,于皆平,等.泛素-蛋白酶體抑制劑對食管癌細胞增殖的影響[J].中國藥理學通報,2004,20(3):355-356.
[6] Adams J, Palombella VJ , Sausville EA, et al. Proteasome inhibitors: a novel class of potent and effective antitumor agents [J]. Cancer Research,1999,59:2615-2622.
[7] Wu HJ, Zhang ZG. Ubiquitin-Proteasome pathway and its significance [J]. Journal of International Pathology and Clinical Medicine,2006,26(1):7.
[8] Inoue S, Nakase H, Mat suura M, et al. The effect of proteasome inhibit or MG132 on experimental inflammatory bowel disease [J]. Clinical and Experimental Immunology,2009,156(1):172.
[9] Melikova MS, Kondratov KA, Kornilova ES. Two different stages of epidermal growth factor (EGF) receptor endocytosis are sensitive to free ubiquitin depletion produced by proteasome inhibitor MG 132 [J]. Cell Biol Int,2006,30(1):31-43.
[10] Letoha T, Somlai C, Takacs T, et al. The proteasome inhibitor MG132 protects against acute pancreatitis [J]. Free Radic Biol Med,2005,39 (9):1142-1151.
[11] Pigneux A, Mahon FX, Moreau Gaudry F, et al . Prot easome inhibit ion specifically sensitizes leukemic cel ls to anthracyclin-induced apoptosis through the accumulat ion of Bim and Bax pro-apoptotic proteins [J]. Cancer Biol Ther,2007,6(4):603-611.
[12] Yan XB, Yang DS, Gao X, et al. Caspase- 8 dependent ost eosarcoma cell apoptosis induced by prot easome inhibitor MG132 [J] . Cell Biol Int,2007,31(10):1136-1143.
[關鍵詞] 硼替佐米; 地塞米松;多發性骨髓瘤
[中圖分類號] R33.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)13-48-03
Bortezomib in Combination with Dexamethasone for Multiple Myeloma:A Clinical Study
SONG Chunge1 HUA Baoyong2
1.The 5th Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China;2.College of Public Health of Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China
[Abstract] ObjectiveTo evaluate the efficacy and safety of bortezomib combined with dexamethasone in the treatment of multiple myeloma (MM). MethodsTwelve patients newly diagnosed as MM and 6 patients with relapsed or refractory MM were treated with bortezomib combined with dexamethasone(bortezomib 1.3mg/m2,d1,4,8,11,dexamethasone 20-40mg,d1-4,8-11) in 3 weeks as a course of treatment. The patients received 1to 6 courses of treatment. Response was evaluated according to the EBMT criteria and adverse reactions were graded according to the NCI-CTCAE(version 3.0). ResultsThe 6-month(2-11months) median follow-up showed out of the 12 patients newly diagnosed MM,two achieved complete response(CR),six partial response(PR),three minor response(MR)and no change for one. The 6 patients with refractory/relapsed myeloma achieved CR(2/6),PR(2/6),NR(1/6)and one died. Clinical response rate was 83.33%). The overall response rate (CR+PR) was 72.22%. The most adverse events observed were fatigue(11/18,61.11%),thrombocytopenia(5/18,27.67%),neutropenia(2/18, 11.11%),diarrhea(3/18,16.67%),peripheral neuropathy(3/18,16.67%)and paroxysmal atrial fibrillation(1/18,5.56%). ConclusionBortezomib combined with dexamethasone is a new and effective treatment for MM patients,with mild adverse reactions.
[Key Words]Bortezomib; Dexamethasone; Multiple myeloma
多發性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一種漿細胞克隆性異常增殖的惡性血液腫瘤[1],多好發于老年患者,在許多國家為發病率第二的血液惡性腫瘤,約占血液惡性腫瘤的10%,常規聯合化療方案完全緩解率(CR)不足10%,中位總生存期僅3年左右,同時骨髓瘤細胞易發生耐藥,并經常復發,成為復發/難治性MM。因此如何提高MM患者的療效就成為血液病中需要解決的難題之一。硼替佐米是一種蛋白酶體的抑制劑,是一種新型的靶向治療藥物,近年來多項研究發現其能有效治療多發性骨髓瘤,在初治和復發難治性MM患者中均取得了一定療效[2-6],同時應用地塞米松可增強抗瘤效果[2]。為進一步了解其療效及不良反應,本研究通過硼替佐米聯合地塞米松治療12例初發及6例復發/難治性MM患者,現報道如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
自2008年2月~ 2009年2月,我們對18例MM患者采用硼替佐米聯合地塞米松化療,初發12例,復發/難治6例;所有MM患者均符合《血液病診斷及療效標準》[7]。其中男11例,女7例,中位年齡為53.5歲(32～77歲);IgG型10例,IgA型4例,IgD型1例,輕鏈型3例,(其中κ型2例,λ型1例)。診斷時Durie-Salmon分期為:ⅡA期2例,ⅢA期13例,ⅢB期3例;ISS分期為Ⅰ期4例,Ⅱ期11例,Ⅲ期3例。病程平均12個月(3～20個月)。其中6例復發、難治患者既往治療包括VAD方案(長春新堿+阿霉素+地塞米松)、M2方案(長春新堿+卡莫司汀+美法侖+環磷酰胺+潑尼松)、VATD方案(長春新堿+阿霉素+地塞米松+沙利度胺)、DVD方案(楷萊+長春新堿+地塞米松)等標準化療至少3個療程。3例患者以劇烈骨痛(均為腰椎壓縮性骨折)為主要表現。
1.2 治療方案
18例所有患者均采用硼替佐米(商品名:萬珂,規格:3.5mg/瓶,美國Ben Venue Laboratories Inc生產)聯合地塞米松治療,硼替佐米1.3mg/m2,第1、4、8、11天快速靜脈注射;地塞米松常規劑量40mg/d,合并糖尿病及感染患者給予20mg/d,第1~4、8~11天靜脈滴注或口服;患者共接受1～6個療程治療(平均3.2個療程),同時每月給予1次帕米磷酸二鈉靜脈滴注輔助治療。
1.3 療效評價
根據EMBT(European Group for Blood and Marrow Transplantation)標準[8],療效分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、輕微反應(MR)、無變化(NC)和疾病進展(PD)。每個療程前均行血常規、肝腎功能、電解質、血尿M蛋白鑒定、免疫球蛋白、蛋白電泳、骨髓形態學及免疫分型等檢查。不良反應評價:根據NCI-CTCAE(National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events,version3.0)標準判斷不良反應,分為1、2、3、4級。
2 結果
2.1 臨床療效
18例接受硼替佐米聯合地塞米松化療的MM患者中位隨訪6個月(2～11個月),15例對治療有反應,總反應率83.33%。12例初治患者中3例CR(25%),6例PR(50%),2例MR(16.67%),1例NC(8.33%),有效率為75%(9/12)。6例難治復發患者中2例CR(33.33%),2例PR(33.33%),1例NR(16.67%),1例死亡(16.67%),有效率為66.67%(4/6)。兩組有效率差異無統計學意義(P>0.05)。中位起效和達最佳療效時間分別為1個療程和4個療程后。其中2例初治患者CR后已進行了自體外周血造血干細胞移植;3例劇烈骨痛的患者癥狀基本緩解;1例難治性患者既往曾接受2個療程的VAD方案及1個療程的M2方案化療,有慢性支氣管炎病史,在給予1個療程硼替佐米+地塞米松聯合方案化療后1周出現高熱合并Ⅰ型呼吸衰竭,1周后死亡。
2.2 不良反應
18例MM患者在治療過程中均出現不同程度的不良反應,主要不良反應為乏力,11例(61.11%)出現乏力癥狀,其中9例為Ⅰ級,2例為Ⅱ級,均未給予特殊處理,療程結束后自行緩解;5例(27.67%)患者出現外周血血小板計數減少,血小板減少CTCAE 1級1例、2級2例、3級1例、4級1例,4級需給予輸注血小板治療,血小板計數最低出現在治療第12～16天,均能在第21天前后恢復。白細胞減少2例(11.11%),CTCAE分級1級;腹瀉3例(16.67%),CTCAE為2級;周圍神經病變3例(16.67%),主要為手足麻木,CTCAE為1～2級;陣發性房顫1例(5.56%),CTCAE為4級,采用延遲療程,并給予強心劑及抗心律失常等治療1d后緩解。以上所有不良反應均可經對癥治療后恢復,無1例患者因藥物相關毒性停用硼替佐米。
3 討論
多發性骨髓瘤目前仍被認為是一種不可治愈的血液系統惡性疾病,采用傳統化療雖可使病情得到一定程度的控制,但緩解率極低,尤其對于難治/復發性MM,很多患者皆因得不到有效治療而死亡,因此積極探討更加有效的化療方案具有重要意義。
近幾年來,隨著對MM生物學特性的深入研究,蛋白酶體得到了格外的關注。蛋白酶體是多酶復合體,存在于所有真核細胞,當蛋白酶體超出其正常生理作用時會引發各種腫瘤。抑制蛋白酶體能提高調節蛋白水平,阻止腫瘤生長,導致腫瘤細胞凋亡,因此抑制蛋白酶體已成為抗腫瘤治療的重要靶點。
硼替佐米(曾用名PS341)是一種人工合成的蛋白酶體競爭性抑制劑,它對26S蛋白酶體具有高度特異性抑制能力,在骨髓瘤細胞中,抑制NF-κB的激活,使骨髓瘤細胞增殖相關基因表達受抑,白介素6(IL-6)等骨髓瘤細胞生長因子、黏附分子等表達減少,最終骨髓瘤細胞發生凋亡。在一項多中心Ⅱ期臨床SUMMIT研究中,硼替佐米顯示出令人鼓舞的療效[2]。202例曾接受過多種治療的復發難治骨髓瘤患者(64%曾接受造血干細胞移植)接受硼替佐米治療的ORR為35%,CR 4%,PR 13%。中位總生存時間17.5個月,明顯高于歷史對照組預期中位生存時間(6～9個月)。另一項多中心Ⅱ期隨機對照CREST研究顯示,硼替佐米1.3mg/m2單藥治療的總反應率高于1.0mg/m2組(50%、33%),而聯合應用地塞米松可使反應率增加18%[9]。APEXⅢ期臨床擴大試驗[10]其ORR達35%,CR+nCR6%。而且,大量研究發現硼替佐米與傳統化療藥物聯合具有協同作用,且未見增強不良反應[5,9,10]。
本研究中的6例難治復發患者經硼替佐米聯合其他化療藥物治療后,2例達CR,2例達PR,提示對傳統化療藥物耐藥的多發性骨髓瘤對硼替佐米治療仍然敏感。本研究中硼替佐米對12例初治患者也取得了一定療效,12例初治患者中3例CR、6例PR、2例MR、ORR為91.67%,其中2例初治患者CR后已進行了自體外周血造血干細胞移植,提示硼替佐米治療不影響自體造血干細胞的動員采集以及移植后的造血重建。
本研究中最常見的不良反應是乏力,其次為血小板減少、白細胞減少、周圍神經病變、腹瀉和陣發性房顫等,除陣發性房顫外均為既往研究中所發現和報道的,且多數為輕度、可逆的,一般化療結束或對癥治療后均可恢復,無1例患者因藥物相關毒性停用硼替佐米。說明硼替佐米的不良反應是可以預見和控制的。故本研究提示,硼替佐米治療初發及難治復發多發性骨髓瘤有較好療效,且嚴重不良反應較少,是一種新的安全、有效、可耐受的方案。但有1例出現陣發性房顫,考慮為患者既往曾有陣發性房顫發作病史,本次化療后再次誘發,故對患有心臟基礎疾病的MM患者,在化療中應同時給予保護心肌治療,動態監測心臟功能,預防心臟急癥發生,為硼替佐米安全有效應用提供更好的保障與依據。
[參考文獻]
[1] Smith RA,Cokkinides V,Eyre HJ. American Cancer Society guidelines for the early detection of cancer,2006[J]. CA Cancer J Clin JT-CA:a cancer journal for clinicians,2006,56(1):11-25;49-50.
[2] Richardson PG,Barlogie B,Berenson NJ,et al. A phase 2 study of bortezomib in relapsed,refractory myeloma[J]. N Engl J Med,2003,348:2609- 2617.
[3] Kropff MH,Bisping G,Wenning D,et al. Bortezomib in combination with dexamethasone for relapsed multiple myeloma[J]. Leuk Res,2005,29:587-590.
[4] Jagannath S,Richardson PG,Barlogie B,et al. Bortezomib in combination with dexamethasone for the treatment of patients with relapsed and/or refractory multiple myeloma with less than optimal response to bortezomib alone[J]. Haematologica,2006,91:929-934.
[5] Mitsiades N,Mitsiades CS,Richardson PG,et al. The proteasome inhibitor PS-341 potentiates sensitivity of multiple myeloma cells to conventional chemotherapeutic agents:therapeutic applications[J]. Blood,2003,101:2377-2380.
[6] Jagannath S,Durie BG,Wolf J,et al. Bortezomib therapy alone and in combination with dexamethasone for previously untreated symptomatic multiple myeloma[J]. Br J Haematol,2005,129:776-783.
[7] 張之南,沈梯. 血液病診斷及療效標準[M]. 北京:科學出版社,2001:218.
[8] Blade J,Samson D,Reece D,et al. Criteria for evaluating disease response and progression in patients with multiple myeloma treated by high dose therapy and haemopoietic stem celltransplantation. Myeloma Subco- mmitte for the EBMT[J]. Br J haematol,1998,102:1115-1123.
[9] Jagannath S,Barlogie B,Berenson J,et al. A phase 2 study of two doses of bortezomib in relapsed or refractory myeloma[J]. Br J Haematol,2004, 127(2):165-172.
[關鍵詞] 銅（Ⅱ）配合物；結構特征；抗癌活性；共價作用；誘導凋亡
[中圖分類號] R979.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）16-30-04
60年代末期，順鉑（cis-platin）做為抗腫瘤藥物應用于臨床，引導金屬配合物抗癌藥物研究步入了一個新領域，引起了人們對金屬配合物抗腫瘤研究的重視。近年來已證實鍺、鉬、鈀、銅、鋅等金屬配合物也具有抗腫瘤活性，對金屬配合物的研究已經成為抗腫瘤藥物研究中的熱點之一[1]。
銅是一種很重要的微量金屬元素，它在人體內的含量僅次于鐵和鋅。所有的動物、植物都需要靠它來生存和維持正常的生理機能。同時銅還是機體內氧化還原體系中有著獨特作用的催化劑。目前已知銅存在于生物體內金屬蛋白和金屬酶的活性部位，對造血系統和中樞神經系統的發育，骨骼和結締組織的形成以及皮膚色素的沉積等過程具有重要作用[2]。銅作為配合物的活性中心還存在于具有生物功能的蛋白質分子中，其配合物多變的配位結構和活化小分子的催化活性，使其對生命體系有特殊的生物活性和催化作用。而目前的研究表明：銅是生物體內正常的新陳代謝所必須的，亦是治療許多疾病的一個主要因素。近期研究也證實銅與腫瘤血管的形成有密切關系，因此銅配合物已成為抗腫瘤藥物的研究熱點。早在1912年，德國就用一種由銅的氯化物和蛋黃素組成的混合物來治療患有面部癌的患者。這一治療的成功說明銅化合物具有抗癌功能[3]。在眾多的過渡金屬中，銅具有良好的配位特性，且其配合物具有良好的光裂解活性[4]，眾多的研究者們開始將銅配合物作為研究對象。
本研究在參閱大量文獻的基礎上，結合自己的工作，從以下幾方面對銅（Ⅱ）配合物抗癌活性的研究進展作了介紹。
1 銅（Ⅱ）配合物的結構特征
Cu（Ⅱ）金屬原子的配位多含O、N原子，Cu（Ⅱ）配位數從4～6多變，配位構型有四面體、三角雙錐、八面體等。既有螯合型的，又有橋聯型的，Cu（Ⅱ）金屬配合物多是雙核的。
胡喜蘭等[5]合成了一種新型雙核銅配合物[Cu（pht）2（ba）2]2，該新型銅配合物中，Cu（II）離子配位于變形的三角雙錐中，兩個銅原子之間與C，O，N原子相互作用橋接構成一個八元環結構，配合物通過氫鍵連接成一個穩定的網狀結構；李慶祥等[6]合成了1-亞甲基苯并瞇唑-1，4，7-三氮環壬烷和[Cu（C14H21N5）Br]2[CuBr4]的銅配合物，研究其結構發現，該配合物由兩個1-亞甲基苯并咪唑-1，4，7一三氮環壬烷一溴合銅配陽離子和一個四溴合銅配陰離子組成。在兩個配陽離子中Cu（II）離子位于一個變形四方錐的中心，在配陰離子中Cu（II）離子與四個溴陰離子配位，位于一個稍變形的四面體的中心。尹富玲等[7]利用聯吡啶的DNA靶向作用及去甲基斑蝥酸根的抗癌、水溶性作用，合成了2，2'-2聯吡啶和去甲基斑蝥酸根合銅（Ⅱ）橋聯三元混配合物，并研究了它的結構特征和抗腫瘤生物活性。配合物中2個銅原子呈六配位的拉長畸變八面體構型，生物測試表明該配合物具有較強的抗癌活性。Ferrari等[8]合成了新的5-甲酰尿嘧啶縮氨基硫脲配合物并用x射線單晶衍射進行了結構表征。發現所有的配合物中配體均以S、N、O通過三螯合來與金屬鍵合。其中銅配合物的結構是四方錐體，配體組成基底的平面四方形。
2 銅（Ⅱ）和鉑（Ⅱ）配合物的活性對比
鉑（Ⅱ）配合物是當今抗腫瘤藥物開發中應用較多的一種，但在使用過程中同時還表現出的一些副作用，如明顯的毒性及抗藥性。多數含有機配體的銅配合物都具有抗細胞增殖活性。反式一二（水楊醛肟）合銅（Ⅱ）和一些大環配體與銅的化合物對實驗性動物腫瘤具有較強的抵抗能力。1，2-雙（二苯基膦）乙烷及相關的苯代二磷化合物對許多腫瘤細胞都具有抑制作用。某些含Cu（Ⅱ）的藥物如丁二酮肟銅，博萊霉素等都表現出抗癌活性。趙喜榮等[9] 研究發現苯乙酮縮氨基硫脲與金屬銅（Ⅱ）形成的二齒配合物具有很好的抗癌活性，對S180腹水瘤細胞的生長有良好的抑制作用。當表阿霉素、絲裂霉素C與銅配合物聯合作用時，對HeLa-S3人宮頸癌細胞的生長有明顯的協同抑制作用，銅與丙二酸衍生物的配合物和表阿霉素及順鉑聯合作用時對人乳腺癌和宮頸癌細胞的生長也有顯著的協同抑制作用。
2004年，張壽春等[10]合成了兩種新型的8-氨基喹啉-蛋氨酸衍生物Cu（Ⅱ）配合物[Cu（CMQA）（H2O）]（Ⅰ）和[Cu（MQA）（Ac）]（Ⅱ）。這兩個配合物具有相似的配位結構，但其細胞毒活性及與GSH之間的反應性能差異比較大。配合物Ⅱ對P-388小鼠白血病細胞和A-549肺癌細胞都有明顯的抑制作用，并且在相同的實驗濃度范圍內其抗腫瘤活性強于順鉑。同時又合成了一種新型三元1，10-菲咯啉-蘇氨酸-銅（Ⅱ）配合物，該配合物對HL-60和SGC-7901腫瘤細胞都顯示出明顯的體外細胞毒活性，且在多數的實驗濃度范圍內其抗腫瘤活性強于順鉑。
Zhong等[11]以新的席夫堿為配體合成了銅絡合物。體外抗腫瘤活性實驗結果表明，新絡合物及其配體對腫瘤細胞有一定程度的抑制作用。賀飛等[12]以DTC為配體合成了一系列新型的DTC金屬絡合物，并對六種人腫瘤細胞進行了體外試驗，結果發現SR-Cu具有較好的抗腫瘤活性，其他的金屬則不具次活性。而以氟喹諾酮類藥物環丙沙星與Cu-2，2-聯吡啶或1-10鄰菲咯啉（phen）形成的雙核銅絡合物對BEL-7402人肝癌細胞和HL-60人白血病細胞均具有較強的抑制作用。
另研究表明，帶Cu動態平衡路徑的金屬鍵合運送器能夠阻止Pt藥物對癌細胞的抵抗力。研究所提供的證據是順鉑和h-Ctrl蛋白質間的直接相互作用，并且證實了順鉑和銅在其輸送過程中具有明顯的生化結果[13]。賈磊等[14]以席夫堿為配體，合成了一種含有鄰菲咯啉和氨基酸的三元雙核銅配合物，對該配合物進行研究后發現，銅配合物在較低濃度時即對HL-60細胞顯示出較高的抑制率，對A-549細胞的抑制率相對低一些。但兩者均比順鉑的抗腫瘤活性要高。
3 銅（Ⅱ）配合物與DNA的作用
核酸（DNA）是一類重要的生命物質，它幾乎包含了細胞功能所有的遺傳信息，對生物的生長、發育和繁殖等起著關鍵的作用。因此DNA在生命過程中扮演著很重要的角色。DNA包含了細胞功能幾乎所有的遺傳信息.因此它在生命過程中扮演了很重要的角色。
但是，一旦DNA分子與其他分子發生反應，其結構極易被破壞，從而導致生物體發生許多病理性改變。生物試驗證明，DNA是抗癌試劑的靶向分子，從抑制癌細胞中DNA分子的角度來講，與DNA相互作用的分子可作為潛在的新治療劑，小分子可與DNA相互作用從而阻止癌細胞DNA的復制，導致癌細胞的死亡。研究抗癌的新藥都是以DNA為作用靶進行設計的[15]。
近年來，過渡金屬配合物作為抗癌藥物和DNA結構探針等方面表現出了巨大的應用前景，受到了人們的廣泛重視。研究金屬配合物與DNA的作用方式與機理，對于探索金屬配合物在生物醫學等領域的應用具有重要的指導意義。從而為合成新抗癌藥物開辟了新的途徑。
由于系統開始研究銅（Ⅱ）抗腫瘤配合物相對較晚，且主要研究目標側重在活性配合物上。銅配合物發揮抗癌作用的原因可能是銅與藥物化合物配位后增加了配合物的親脂性，使其更易跨膜進入細胞內，進一步對癌細胞DNA的插入或其它方式以破壞DNA堿基對間的氫鍵，使DNA損傷失去復制功能而發揮作用。最近美國相關研究表明：實體性腫瘤患者服用適量的銅的配合物治療后，腫瘤的生長和轉移得到了明顯的抑制，從而提高了生存率。但這些配合物并不是消滅了癌細胞，只是將其轉化為了正常細胞。報道已合成出了一系列具有核酸酶活性的銅配合物.如單核銅配合物，雙核銅配合物及多核銅配合物等[16]。另有文獻報道[17]：配合物與DNA作用主要有共價鍵結合，插入結合，靜電作用和溝槽結合四種基本方式。
多吡啶銅配合物與DNA之間有相互作用，有些還存在插入結合。一些抗腫瘤藥物分子就是通過插入DNA從而使DNA的構象發生改變，使其無法進行復制而顯示出抗腫瘤活性[18]。另有研究發現水楊醛類希夫堿的過渡金屬配合物對DNA具有選擇性斷裂作用，氨基酸分子的引入能夠增強藥物的脂溶性，緩解對細胞的毒性[19]。銅配合物因具有核酸酶活性引起了研究者的極大興趣。如dimetallo-copper-bipyridyl porphyrins20就可以通過插入結合的方式與DNA鍵合，還可以在一定條件下連接和附著于DNA上。其獨特的結構對于DNA的影響在分子生物學實驗和藥物設計上都是很有價值的[20]。
Sigman等[21]于1979發現，Cu（phen）2及其肽或蛋白質衍生物的核酸酶活性甚至優于天然核酸酶。該配合物與DNA的反應在還原劑H2O2或硫醇存在時，對核酸聚合酶有抑制作用；張壽春[10]合成了一種新型三元1，10-菲咯啉-蘇氨酸-銅（Ⅱ）配合物，該配合物以嵌入方式與DNA結合，當以抗壞血酸作為還原劑時，配合物還能顯著切割超螺旋pBR322 DNA。機理研究表明，該切割反應的活性部位可能為羥基自由基。
4 銅（Ⅱ）配合物與氨基酸的共價作用
氨基酸是生物體不可缺少的物質，它是構成蛋白質并同生命活動有關的基本單元，可以識別DNA的特殊堿基對。
一些氨基酸席夫堿配合物具有抑菌、抗癌等生物活性，這類化合物的研究已經相當活躍。特別值得一提的是，由于氨基酸特有的羧酸基團，更利于金屬的配位，再加上癌變細胞對氨基酸的需求量比正常細胞大得多，因而銅與氨基酸的配合物就可能將抗癌基團運載到癌變細胞內，從而提高到達靶標的有效劑量，增大殺傷癌變細胞的選擇性。氨基酸銅配合物切割DNA的研究受到了人們的廣泛關注，因此含有氨基酸的銅化合物可以作為模板被用來研究含有銅的生物酶的作用模式，已有報道表明某些含有氨基酸的銅配合物具潛在的抗癌活性及人造核酸酶的性質[22]-蘇氨酸的引入可能使配合物與DNA之間發生選擇性相互作用，并且L-蘇氨酸作為輔助配體，可以有效改變Cu-phen配合物的人工核酸酶和抗腫瘤活性[23]。
陳建化等[24]成了N-（2-羥基萘甲醛）甘氨酸席夫堿配體及其銅（Ⅱ）、鎳（Ⅱ）的配合物，通過動物體內抗癌活性試驗表明，配體對小白鼠EAc（艾氏腹水癌細胞）無抑制作用，而其銅配合物卻有一定的抑制作用。
5 銅（Ⅱ）配合物對癌細胞的誘導凋亡作用
細胞凋亡是生物體組織中發生的程序性細胞死亡過程。研究表明，金屬元素可以誘導細胞凋亡的發生。而關于金屬配合物對細胞凋亡的作用研究并不多見。
梁峰等[25]研究了含羥基三氮環多氨銅配合物對肝癌細胞BEL-7402的誘導凋亡行為，結果發現銅配合物主要在機體內通過調節氧化損傷機制來參與細胞凋亡的過程。Dou，Chen等[26]報道了一系列的銅配合物抑制惡性腫瘤細胞中蛋白酶體的活性進而誘導腫瘤細胞凋亡的現象。Milacic等[27]研究了Cu（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）離子對純20S蛋白酶體的抑制作用，比較發現二者的IC50分別為5.3μm和13.8μm，還研究了Cu（Ⅱ）配合物抑制蛋白酶體活性的能力及對細胞凋亡的誘導作用，結果發現其能通過抑制蛋白酶體的活性進而誘導腫瘤細胞的凋亡。體內或者體外試驗中，有機配體可以與游離的或腫瘤細胞表皮內的銅離子反應生成蛋白酶體抑制劑，進而誘導前列腺癌細胞及人乳腺癌細胞凋亡。Adsule等[28]合成了4個喹啉-2-甲醛衍生的席夫堿化合物，并使其分別與銅（II）形成1∶1的配合物，體外實驗表明這8個化合物都能夠抑制前列腺癌細胞系LNCaP和PC-3細胞的蛋白酶體糜蛋白酶樣活性，誘導細胞凋亡。Daniel等[29]報道了有機銅配合物NCl-109268、8-羥基喹啉銅（II）配合物Cu（8-OHQ）2能有效并選擇性地抑制白血病細胞蛋白酶體麇蛋白酶樣活性，誘導白血病細胞凋亡。
Dou等[30]報道了一系列銅配合物，該配合物作為蛋白酶體抑制劑具有抗腫瘤活性。體外實驗發現有機銅配合物與銅離子相比，前者不但體外可以抑制純化的20S蛋白酶體，而且可以通過抑制整細胞中26S蛋白酶體的活性進而誘導腫瘤細胞凋亡，成為具有研究價值的蛋白酶體抑制劑。
6 結論
由于癌癥仍在威脅著人類的健康與生命，而人類還遠遠沒有征服它甚至對它的認識還很不夠。因此可以預見，開展對癌癥進行治療的探索和研究仍是今后人們所關注的問題。金屬配合物作為抗癌藥物，目前多數仍處于試驗階段，深入研究抗癌金屬配合物與腫瘤細胞的作用機制，設計和合成出新型高效低毒的金屬抗癌化合物是當前的重要任務。隨著越來越多的具有抗癌活性的金屬配合物藥物被發現，及人們對其抗癌活性研究的逐步深入，將會有更多的金屬配合物作為抗癌藥物應用于臨床。
[參考文獻]
[1] 周雙生，程俊，魯傳華，等.N-取代四氮雜大環鑭（Ⅲ）配合物的合成及其生物活性[J].中國藥物化學雜志，2007，17（4）：246-248.
[2] 王飛利，常艷玲，安麗榮，等.非鉑類金屬抗癌化合物的研究進展[J].化學研究與應用，2003，15（5）：612-616.
[3] 劉新勇，劉洛生，王慧才，等.鉑（Ⅳ）類配合物的合成及其抗腫瘤活性[J].中國藥物化學雜志，2002，12（5）：272-275.
[4] 孫獻茹，程鵬，廖代正，等.草酸根橋聯的釩氧銅配合物的合成、表征及抗腫瘤活性研究[J].化學通訊社，1997，12（4）：44
[5] 胡喜蘭，施鵬飛，徐興友，等.雙核銅配合物[Cu（pht）2（ba）2]2的合成、晶體結構和抑菌活性[J].人工晶體學報，2009，38（5）：1285-1289
[6] 李慶祥，沈云軍，孟祥高.1-亞甲基苯并咪唑-1，4，7-三氮環壬烷配體及其銅配合物[Cu（C14H21N5）Br2].[CuBr4]的合成與晶體結構[J].化學學報，2008，66（2）：268
[7] 尹富玲，申佳，鄒佳嘉，等.2.2-聯吡啶和去甲基斑蝥酸根橋聯雙核銅（Ⅱ）配合物的合成、結構表征及抗癌活性的研究[J].化學學報，2003，6l（4）：556―561.
[8] Ferrari MB，Bisceglie F，Pelosi C，et al.Synthesis，characterisation，X-ray structure and biological activity 0f three new 5-formyluracil thiosemicarbazone complexes[J].J Inorg Biochem，2001，83（2-3）：169-179.
[9] 趙喜榮，莫簡.對氯對甲氧基苯乙酮縮氨基硫脲合銅（Ⅱ）配合物的合成表征及其抗癌活性[J].藥學學報，2002，17（3）：137-139.
[10] 張壽春.新型含鉑、銅絡合物杭腫瘤活性與DNA切割活性研究[D].南京：南京大學，2004：53-56.
[11] Jie Liu，Tixiang Zhang，Tongbu Lu，et al.DNA-binding and cleavage studies of macrocyclic copper（II）complexes[J].J Inorg Biochem，2002，91：269.
[12] 俞志剛，丁為民，紀紅蕊，等.1-對氯苯基-3苯基-4-苯甲酰基-吡唑啉酮-5縮胺類席夫堿銅配合物的合成與抑菌活性[J].有機化學，2010，30（9）：1363.
[13] 周建良，春曉改，周琳姣，等.新型三元銅配合物的合成、晶體結構及與DNA的相互作用[J].無機化學學報，2010，26（4）：645-650.
[14] 賈磊，唐寧.含有鄰菲咯啉和氨基酸支鏈的三元銅（Ⅱ）配合物的合成，表征，DNA-binding性質及其抗癌活性的研究[J].安徽大學學報（自然科學版），2010，34（2）：104-107.
[15] Lainé M，Richad F，Tarnaud E，et al.Synthesis of novel types of copper-bipyridy l porphyrins and characterization of their interactions and reactivity with DNA[J].J Inorg BioChem.2004，9：550-562.
[16] hang S，Zhu Y，Tu C，et al.A novel cytotoxic ternary copper（II） complex of 1，10-phenanthroline and L-threonine with DNA nuclease activity[J].J Inorg Biochem，2004，98：2099.
[17] Geromichalos GD，Katsoulos GAA，Had-Jikostas CC，et al.In vitro synergistic effects of some novel Cu（Ⅱ）complexes in combination with epirubicin and mitomycin C against HeLa_S3 cervical cancer cell line[J].Anticancer Drugs，1996，7（4）：469-475.
[18] 王彥美，韓杰，周紹兵.鉑抗癌藥物研究進展[J].合成化學，2003，11（1）：27-29.
[19]宋智軍，樂學義.多吡啶氨基酸銅配合物研究進展[J].廣東化工，2004，6：22-24.
[20] Belicchi FM，Bisceglie F，Pelosi G，et al.Synthesis，characterrization and X-ray structures of new antiproliferative and proapoptotic natural aldehyde thiosemicarbazones and their nickel （Ⅱ）and copper （Ⅱ）complexes[J].J Inorg Biochem，2002，90（3-4）：113-126.
[21] 孫穎.8-羥基喹啉衍生物化合物庫的設計、合成與抗癌活性的初步研究[D].濟南：山東大學，2009：41-45.
[22] 蔡小強，潘逆娜，鄭忠亮.菲咯啉銅配合物與組蛋白H1的相互作用[J].武漢大學學報（理學版），2008，54（4）：443-446.
[23] 馬小芳，田金磊，顧文.水楊醛縮酪氨酸還原Schiff堿銅配合物的合成、結構及與DNA鍵合作用的光譜學研究[J].南開大學學報（自然科學版），2008，41（1）：61-64.
[24] 陳建華，李常勝，李習俊.N-（2-羥基萘甲醛）甘氨酸席夫堿及其銅（Ⅱ）、鎳（Ⅱ）配合物的合成、表征和抗癌活性[J].中國藥物化學雜志，1995，5（3）：192.
[25] 梁峰，吳成泰，李朝陽，等.含羥基三氮環多氨銅配合物誘導細胞凋亡研究[J].南開大學學報（自然科學版），2008，41（1）：61-64.
[26] 王碩.鄰菲羅啉銅錳鈷配合物及其抗癌抗腫瘤活性[D].北京：首都師范大學，2008：48-52.
[27] Pattubala ANR，Bidyut KS，Munirathinam N，et al.Metal-assisted light-induced DNA cleavage activity of 2-（methylthio）phenylsalicylaldimine Schiff base copper（II）complexes having planar heterocyclic bases[J].J Inorg Biochem，2004，98：377.
[28] 高恩君，程卯生，王克華.鈀配合物抗癌活性研究進展[J].中華醫藥雜志，2006，2：45.
[29] 古琴，樂學義.銅（?）二肽配合物的配位形式、結構和穩定性研究進展[J].化學研究與應用，2006，18（2）：113-118.
【摘要】 目的 探討膜聯蛋白A7氧化修飾水平變化在帕金森病(PD)發病機制中的可能作用。方法 應用10 μmol/L PSI處理PC12細胞24 h建立PD細胞模型。通過2，4二硝基苯肼(DNP)的衍生將含有羰基的氧化蛋白質標記上。首次采用2D凝膠電泳、質譜鑒定與免疫印跡技術相結合的方法比較PD細胞模型和正常對照組中膜聯蛋白A7氧化修飾水平的變化。結果 與對照組比較，PD細胞模型中膜聯蛋白A7氧化修飾水平顯著降低(P
【關鍵詞】 帕金森病;膜聯蛋白A7;發病機制;氧化修飾;蛋白質組學鑒定
研究表明，帕金森病(PD)黑質多巴胺能神經元內蛋白質羰基水平顯著升高〔1〕。因此，目前多數學者將興趣集中于氧化應激損害，認為氧化應激在PD黑質多巴胺能神經元死亡過程中起重要作用。迄今為止，尚未見膜聯蛋白A7(annexin A7)發生氧化修飾的報道。本實驗通過2，4二硝基苯肼(DNP)的衍生步驟將含有羰基的氧化蛋白質標記上，而后采用2D凝膠電泳、質譜鑒定與Western印跡技術相結合的方法首次發現了annexin A7氧化修飾。期望為PD發病機制的研究及治療藥物的研發提供線索。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器 PC12細胞購自中國科學院上海細胞庫。高糖DMEM培養基購自Gibco公司。新生牛血清由杭州四季青生物制品廠生產。吖啶橙、二抗、顯色液等購自Sigma公司。溴化乙啶為Amresco產品。熒光倒置相差顯微鏡為日本Olympus產品;低溫高速離心機為Heraeus Sepatech產品。DNP購自東京化工業株式會社。一抗購自Molecular Probe公司。硝纖膜、Cleanup及2D Quant試劑盒、固相13 cm IPG膠條、聚焦儀、電泳系統、凝膠圖像掃描儀、2D Evolution分析軟件和質譜儀為Amersham Biosciences公司產品。
1.2 方法
1.2.1 PD細胞模型的建立 PC12細胞復蘇后，以2×105/ml的密度接種于底面積25 cm2的塑料培養瓶(10 ml/瓶)，于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養。每2～3 d更換1次培養液。選取對數生長期細胞進行傳代。細胞以1×105/ml密度接種于底面積25 cm2的塑料培養瓶。24 h后更換培養液，實驗組加入終濃度10 μmol/L的PSI(以DMSO溶解)，對照組加入DMSO，實驗組與對照組DMSO終濃度均為0.1%，繼續孵育24 h后收集兩組細胞用于實驗。MTT法檢測細胞存活率;吖啶橙和溴化乙啶染色觀察細胞凋亡的存在;HE染色觀察細胞內包含體的形成。
1.2.2 蛋白樣品的制備 傾去培養液，以冷PBS洗滌3次，計算細胞重量。按重量比1∶10加入裂解液，室溫作用1 h。離心30 min，收集上清液。應用Cleanup試劑盒去除雜質，2D Quant定量試劑盒進行蛋白質定量(樣品濃度控制在5～10 mg/ml)。
1.2.3 一向等電聚焦電泳及IPG膠條的DNP衍生 240 μg樣品與一向電泳緩沖液混合后均勻加入膠條槽，IPG膠條膠面朝下放入膠條槽，在電泳儀上進行水化及等電聚焦電泳。而后將IPG膠條在含20 mmol/L DNP的2 mol/L的HCl溶液中室溫孵育20 min，而后在含30%甘油的2 mol/L TrisBase溶液中洗15 min。
1.2.4 二向凝膠電泳 將平衡后的IPG膠條轉移至12.5% SDSPAGE凝膠(16 cm×15 cm×1.0 mm)上端，在垂直電泳儀上進行二向電泳。待溴酚藍距底邊約4 cm時停止電泳。
1.2.5 分析膠進行免疫印跡染色 將用作分析膠的二向膠電轉移至硝酸纖維素膜。以3%BSA/TBST封閉硝酸纖維素膜。以1∶200的兔抗鼠DNP抗體作為一抗，4℃過夜孵育。以1∶10 000的羊抗兔堿性磷酸酶偶聯抗體作為二抗，室溫孵育1 h。以BCIP/NBT溶液作為顯色液，至藍紫色蛋白點清晰呈現后，以雙蒸水終止反應。
1.2.6 制備膠進行熱考馬斯亮藍染色 制備膠于20% TCA中固定2 h以上。蒸餾水漂洗凝膠20 min，加入熱考染液，50℃搖床振蕩30 min。加入脫色液，50℃搖床振蕩脫色，每次1 h，以背景藍色脫凈為止。
1.2.7 圖像分析、統計學處理及質譜鑒定 掃描Western印跡及考染的制備膠圖像，應用Image Master 2D Evolution軟件進行分析，在制備膠上找到與Western印跡結果相匹配的蛋白點。以單個蛋白抗DNP免疫染色強度/制備膠蛋白考染強度來標準化蛋白的氧化水平，對來自4次重復實驗的結果以x±s表示，采用t檢驗。對與對照組比較PSI處理組氧化水平有顯著差異的蛋白點進一步做質譜鑒定。
2 結 果
2.1 細胞模型結果 10 μmol/L PSI作用PC12細胞24 h的情況下，細胞存活率降至(85.46±1.75)%，與對照組(高為100%)比較有顯著性差異(P
2.2 蛋白質的鑒定結果 掃描考染的制備膠及Western印跡圖像，可見制備膠上的蛋白點與Western印跡圖像匹配較好(見圖1)。應用2D Evolution軟件進行分析，與對照組比較有統計學意義的表達顯著降低的蛋白點有8個(P
圖1 蛋白點99在實驗組和對照組考染的制備膠及Western印跡上表達比對
3 討 論
PD的基本病理特征為黑質致密部多巴胺能神經元變性缺失，殘存的神經元胞漿內出現嗜酸性包含體即Lewy小體。尸檢研究表明PD黑質多巴胺能神經元內蛋白質羰基水平顯著升高。羰基是蛋白質氧化的標志之一，反應性羰基作為氧化損傷的神經毒性介質涉及許多神經系統變性疾病的進展〔2〕。羰基通過修飾細胞親核基團及破壞細胞動態平衡在神經變性病的發病機制中發揮重要作用〔3〕。
泛素蛋白酶體系統(UPS)是細胞內重要的非溶酶體蛋白降解途徑，可清除真核細胞內突變、損傷及異常折疊的蛋白質，起到調控蛋白質和維持細胞內環境穩定的作用〔4〕。有研究表明，蛋白酶體抑制劑處理的動物及細胞模型可導致自由基的生成及氧化應激，較全面地模擬PD的病理特征，如細胞凋亡死亡、αsynuclein異常、酪氨酸羥化酶損傷及包含體形成〔5，6〕，提示有必要在蛋白酶體抑制的PD模型中研究氧化應激機制。
本實驗在蛋白酶體抑制的PD細胞模型中，首先通過DNP的衍生步驟將含有羰基的氧化蛋白質標記上，而后采用2D凝膠電泳、質譜鑒定與Western印跡技術相結合的方法鑒定氧化修飾的蛋白質。結果首次在蛋白酶體抑制的PD模型中發現了annexin A7的氧化修飾，與對照組比較其氧化水平顯著降低。
蛋白點99被鑒定為annexin A7。Annexin是一組高度同源的鈣依賴磷脂結合蛋白，迄今為止在哺乳動物中已發現13種annexin。基于annexin A7在體外能聚集嗜鉻顆粒，因而是第一個被分離的annexin鈣結合蛋白〔7〕。除腎上腺髓質外，已在許多哺乳動物組織中檢測到annexin A7，包括腦、肝臟、腮腺、脾、肺及骨骼肌〔8，9〕。在細胞水平，annexin A7涉及膜運輸、胞外分泌、鈣離子動態平衡及腫瘤抑制等多種生物學功能。
一些證據顯示鈣結合蛋白在損傷的和/或衰老的腦組織中發揮保護作用〔10〕。有研究表明在神經變性病AD中，表達高水平鈣結合蛋白的神經元不發生變性〔11〕，表達鈣結合蛋白的培養的神經細胞對興奮性氨基酸或淀粉樣肽誘導的細胞死亡有相當的抵抗性〔12〕。因此推測腦皮層神經元內annexin鈣結合蛋白的豐富表達，可能是嚙齒動物腦對AD型病理過程相對抵抗的一個因素。
Krapfenbauer等〔13〕用神經毒素海人藻酸處理大鼠腦組織，用蛋白質組學的方法檢測到了在凋亡發生時annexin A7的豐度降低。Yu等〔14〕進一步發現，在凋亡因子刺激的條件下，annexin A7的下調可阻止半乳凝素3發揮抗凋亡作用。這提示本實驗中annexin A7氧化修飾水平的降低可能與PD細胞模型中發生的凋亡有關;另一方面，殘留annexin A7的氧化修飾則進一步影響其行使正常的生物學功能。鈣離子依賴的信號轉導路徑功能異常可能涉及PD的發病機制，對信號轉導路徑關鍵步驟的干預可能阻止凋亡的進程。鈣依賴的磷脂結合蛋白annexin A7在PD等神經系統變性病中的可能作用值得進一步深入研究，同時可能為PD分子靶向藥物治療的研發提供有價值的線索。
參考文獻
1 Alam ZI，Daniel SE，Lee AJ，et al.A generalised increase in protein carbonyls in the brain in Parkinson′s but not incidental Lewy body disease〔J〕.J Neurochem，1997;69(3):13269.
2 Sohal RS，Agarwal A，Agarwal S，et al.Simultaneous overexpression of copper and zinccontaining superoxide dismutase and catalase retards agerelated oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster〔J〕.J Biol Chem，1995;270(26):1567174.
3 Picklo MJ，Montine TJ，Amarnath V，et al.Carbonyl toxicology and Alzheimer′s disease〔J〕.Toxicol Appl Pharmacol，2002;184(3):18797.
4 Pickart CM.Mechanisms underlying ubiquitination〔J〕.Annu Rev Biochem，2001;70(5):50333.
5 Rideout HJ，Larsen KE，Sulzer D，et al.Proteasomal inhibition leads to formation of ubiquitin/alphasynucleinimmunoreactive inclusions in PC12 cells〔J〕.J Neurochem，2001;78(4):899908.
6 McNaught KS，Perl DP，Brownell AL，et al.Systemic exposure to proteasome inhibitors causes a progressive model of Parkinson′s disease〔J〕. Ann Neurol，2004;56(1):14962.
7 Brownawell AM，Creutz CE.Calciumdependent binding of sorcin to the Nterminal domain of synexin (annexin Ⅶ)〔J〕.J Biol Chem，1997;272(35):2218290.
8 Clemen CS，Herr C，Lie AA，et al.Annexin Ⅶ:an astroglial protein exhibiting a Ca2+dependent subcellular distribution〔J〕.Neuroreport，2001;12 (6):113944.
9 Magendzo K，Shirvan A，Cultraro C，et al.Alternative splicing of human synexin mRNA in brain，cardiac，and skeletal muscle alters the unique Nterminal domain〔J〕.J Biol Chem，1991;266(5):322832.
10 Pascale A，Etcheberrigaray R.Calcium alterations in Alzheimer′s disease:pathophysiology，models and therapeutic opportunities〔J〕. Pharmacol Res，1999;39(2):818.
11 Iacopino AM，Quintero EM，Miller EK.CalbindinD28K:a potential neuroprotective protein〔J〕.Neurodegeneration，1994;3(1):120.
12 Guo Q，Christakos S，Robinson N，et al.Calbindin D28k blocks the proapoptotic actions of mutant presenilin 1:reduced oxidative stress and preserved mitochondrial function〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1998;95(6):322732.
關鍵詞： 糖尿病；愈合；創面
隨著世界各國社會經濟的發展，居民生活水平的提高，由于飲食結構的改變、日趨緊張的生活節奏以及少動多坐的生活方式等諸多因素，全球糖尿病發病率及患病率增長迅速，糖尿病已經成為繼腫瘤、心血管病變之后第三大嚴重威脅人類健康的慢性疾病。糖尿病患者皮膚易受損傷，損傷后往往反復發作，遷延不愈，形成頑固難愈性潰瘍。因此，糖尿病潰瘍的治療是臨床急需解決的重要課題之一。隨著近年來分子生物學等學科的發展，對糖尿病創面愈合機制的研究也日趨深入，圍繞信號通路、血管生成、神經肽、糖基化終末產物、細胞凋亡及基質金屬蛋白酶等方面的研究逐漸成為熱點。
1 信號轉導通路
創面的愈合需要多種細胞、細胞因子和細胞外基質等因素的共同參與。各因素通過細胞因子相互作用，共同協調，構成一個復雜的生物網絡。任何一種細胞因子的缺乏都可能導致創面不愈或愈合延遲。同時，細胞因子與靶細胞受體間信號轉導“失耦聯”以及多種因子間網絡調節“失控”也可能是導致創面不愈的關鍵因素。
1．1 轉化生長因子β(TGFβ)與smad信號通路
TGFβ有β1～β5五個亞型，哺乳動物體內，TGFβ13是主要的三種，其中又以TGFβ1占大多數。smad蛋白家族是把TGFβ與其受體結合后產生的信號從胞質傳導到細胞核內的中介分子，各類smad蛋白相互聯系制約，并通過不同途徑參與TGFβ的信號轉導。
TGFβ1可以促進成纖維細胞的遷移、增殖，強烈趨化成纖維細胞和炎性細胞，抑制上皮細胞生長但加速血管形成，可以通過刺激成纖維細胞合成膠原等細胞外基質、抑制基質蛋白酶活性并增強膠原酶抑制劑的表達來調節ECM蛋白的表達，在創面愈合的早期TGFβ1即被釋放，傷后5～7 d呈現第二個高峰。傷口愈合過程中內源性Smad3的表達、激活與炎癥反應的啟動、結束及膠原合成密切相關。
糖尿病患者潰瘍區TGFβ1正常的傷后上調反應缺失，而TGFβ3卻表達上調，可以部分地解釋其慢性難愈創面的特點；Chesnoy等［1］通過糖尿病小鼠創面皮內注射質粒DNA來轉染TGFβ1基因發現：創面的細胞增殖率和細胞外新生基質的密度、有序性排列比對照組明顯提高，且愈合時間可提前約50％。
1．2 Ras信號通路
Ras信號通路在糖尿病創面愈合延遲或不愈病理機制中扮演著重要的角色，并逐漸成為研究的熱點。Ras信號通路包括如下幾部分(1)細胞外生長因子與受體偶聯；(2)受體二聚化激活；(3)絲裂原活性蛋白激酶(MAPK)級聯反應；(4)核內活化蛋白1(AP1)激活；(5)基因的轉錄和表達。
信號轉導的復雜網絡需要傳遞信號分子精確的時空排列，當脫離原本正常的細胞環境，許多轉信號分子就雜亂的相互作用。初步研究認為高糖抑制Ras信號途徑受體和其中的關鍵激酶Ras、Raf的磷酸化活化［2］，信號分子表達異常，細胞周期停滯于G0、G1期，細胞增殖的乏力可能促發凋亡，增生細胞減少，凋亡細胞增多顯然會破壞創面愈合，可能是通路失活的主要原因。
1．3 Wnt信號通路
Wnt細胞信號轉導途徑是調控細胞生長、發育和分化的關鍵途徑。在腫瘤的發生、侵襲轉移、細胞黏連極性及細胞凋亡等方面成為目前的研究熱點。目前已知的Wnt作用機制有兩種：規范途徑和非規范途徑。
規范途徑: Wnt與受體卷曲蛋白Frz及低密度脂蛋白相關蛋白LRP5／6結合，胞內散亂蛋白Dsh與Frz胞內區結合后被磷酸化激活，抑制絲／蘇氨酸激酶GSK3β活性，使得βcatenin不能被磷酸化，不能被泛素蛋白酶體系統降解。不能降解的βcatenin在胞質內大量積累并進入核內，與轉錄活化因子TCF／LEF結合，啟動下游靶基因的表達。無Wnt信號刺激細胞時酪蛋白激酶I(casine kinase，CKI)將細胞質中βcatenin的Ser45磷酸化，磷酸化后的βcatenin與軸蛋白Axin，GSK3β，結腸腺瘤肉病基因蛋白APC等形成“破壞復合體”，復合體中的GSK3β相繼使βcatenin的Ser41，Thr33，Thr37磷酸化而使βcatenin能被泛素連接酶復合體E3的亞單位βTrCP(Btransducin repeatcontaining proteins)識別，經蛋白酶體途徑降解，因而此時細胞內的βcatenin水平較低。
非規范途徑：Wnt只與Wnt受體復合物的亞基Frz作用，而不需要LRP5/6，包括Wnt/Ca2+通路和平面細胞極性信號通路。
既往在腫瘤的研究中發現：βcatenin不僅受經典的Wnt信號調控，而且受前列腺素PGE/EP2信號，表皮生長因子EGF/EGFR/PI3K/AKT，以及鈣粘蛋白Ecadherin信號調控，這些分子之間有較為復雜的crosstalk系統［3］。而目前的研究發現：高糖通過PI3KAkt信號途徑抑制內皮細胞遷移和增殖及血管發生改變，也能引起黏附分子Ecadherin的上調。ChunLiang Lin等［3］報道，Wnt/βcatenin信號的上調能提高高糖導致的腎系膜細胞的活性；研究表明：Wnt以及βcatenin表達增強，表皮細胞的增殖、分化和遷移能力增強，且創面愈合加快［4，5］；皮膚角質化細胞wnt信號途徑影響創傷后皮膚的厚度及色素沉著［6］；wnt信號途徑參與保護高糖導致的血管內皮細胞的損傷［7］。
2 血管生成與創面愈合
摘要Metacaspase是由YCA1/MCA1編碼的一種哺乳動物caspases同系物。由于其分子結構的差異，使其斷裂為不同的特異性底物。在哺乳動物中，凋亡被一組蛋白酶caspases定向激活，斷裂特異性底物且觸發細胞死亡。環境損傷、細胞內缺陷、預凋亡基因的異源表達誘導具有典型凋亡特征的酵母細胞死亡與metacaspase緊密相關。刪除metacaspase可以阻礙不同因素引起的死亡，metacaspase在酵母細胞凋亡中具有核心作用。
關鍵詞酵母;YCA1;凋亡
AbstractMetacaspase is a kind of mammal caspases homolog which coded by the YCA1/MCA1 gene. It can break into different specificity substrates because its difference in molecular structure. In mammals，apoptosis can be activated directly by a group of proteases，called caspases，then cleave specific substrates and trigger cell death. Damaging environment，certain intracellular defects and heterologous expression of pro-apoptotic genes inducing death in yeast cells exhibiting typical markers of apoptosis was closely related with themetacaspase. Metacaspase deletion may hinder the death which was caused by different factors. Metacaspase played a central role in yeast apoptosis progress.
Key wordsyeast;YCA1;apoptosis
細胞凋亡(apoptosis)或編程性細胞死亡(programmed cell death，PCD)是一個高度被協調的細胞自殺過程，其對健康狀態的維持和組織功能起決定性作用，細胞凋亡紊亂可導致癌癥或神經退行性病變(neurodegenerative disorders)。
細胞有多種死亡方式，細胞凋亡應指僅僅是形態改變的細胞死亡。這些改變包括細胞聚集，細胞體積變小，染色質濃縮，核斷裂，胞質細胞器少有或沒有超微結構修飾，磷脂酰絲氨酸外翻，質膜起泡和維持質膜完整性直到凋亡晚期。雖然酵母基因組中沒有哺乳動物Bax和Bcl家族的基因類似物，但由Bax介導的釀酒酵母細胞死亡具有典型的凋亡特征，如細胞膜表面的磷脂酰絲氨酸外翻，細胞色素C釋放，膜起泡，染色質凝聚和邊緣化，DNA斷裂。若同時表達Bcl-xL可阻止這些現象發生和細胞死亡[1]。釀酒酵母基因組突變誘導的細胞死亡也具有哺乳動物凋亡細胞的表型特征[2]。酵母細胞死亡涉及的一些基因已被證實為后生動物凋亡調控子。被研究的哺乳動物凋亡級聯的一些必要元件的酵母類似物有caspase [3]，Omi [4]，AIF [5] and Endo G [6]，這說明凋亡的基本元素在單細胞有機體中是確實存在并起功能的。隨著研究的深入，人們已經認識到，凋亡不僅存在于多細胞生物中，也存在于單細胞真核生物中，近年來，釀酒酵母發生凋亡已被公認。
1Metacaspase
Caspases是一組存在于胞質溶膠中的結構上相關的半胱氨酸蛋白酶。其命名由半胱氨酸依賴天冬氨酸的特異性而來。Metacaspase是caspases和paracaspase的同系物。Uren等通過PSI-BLAST研究發現metacaspase和paracaspase。以前的酵母基因組分析表明其不存在caspase，但通過序列比較發現ORF YOR197w編碼一個類caspase蛋白，符合1型metacaspase的被命名為MCA1。后來因為YOR197w可被作為酵母的一個真實的caspase基因并被更名為YCA1[7]。
分子水平的系統進化分析表明，植物、真菌和原生動物的metacaspases 在進化上起源于caspases。酵母YCA1具有caspase的保守結構域。雖然保守，但差異是不可避免的。caspase特異性斷裂天冬氨酸，其分為起始caspase(caspase 8， 9，10，12)和效應caspase(caspase 3，6，7)2類，而酵母只有YCA1，其在N末端含有1個富含脯氨酸的區域，酵母中的YCA1被激活起始通過水解掉1個12kDa的小亞基。但酵母的metacaspase和部分植物的metacaspase具有精氨酸、賴氨酸特異性。
雖然酵母YCA1與動物caspase在分子結構和斷裂特異性底物上存在一些差異，但它們都介導細胞凋亡過程。YCA1是酵母中迄今發現的僅有的類caspase蛋白，YCA1在外源刺激和內源信號引起的眾多凋亡過程中起核心作用。
2生理條件下的酵母凋亡與YCA1的作用
酵母細胞在時序衰老[8]、殺傷毒素產生的生理條件下發生的凋亡需要YCA1。時序衰老死亡的酵母菌顯示典型的凋亡特征，如氧自由基的積累和YCA1的活化。通過刪除YCA1可增加其長期培養的存活率進而破壞凋亡機制，雖然對整個菌落是不利的[8]。德爾飲食限制一段時間后，即使有可利用的營養，衰老的YCA1缺陷株也不能再生長，使菌落產生嚴重損傷和大量老細胞。這顯示酵母凋亡的生理作用在衰老相關細胞死亡中進行適當細胞的選擇起重要作用。對整個種群具有“清潔”效應。
產生殺傷毒素的細胞表型在多種酵母屬種中普遍存在，損傷與低分子量蛋白或糖蛋白毒素(殺傷毒素)的分泌相關，其能殺傷敏感的細胞，在第2階段的受體介導進程中沒有細胞間的直接接觸。在酵母中發現3個不同的殺傷毒素(K1，K2，and K28)，其由細胞質雙鏈RNA病毒編碼，作為分泌α/β毒素的前體。在低濃度下，這3個病毒編碼酵母毒素誘導凋亡標志的死亡。酵母YCA1和ROS介導這個過程。相反，高濃度誘導壞死，而不是凋亡，其不依賴YCA1和 ROS[9]。所以，在自然環境中，毒素濃度是低的，殺傷細胞通過誘發凋亡能清除競爭的敏感細胞。
3外源刺激誘導酵母凋亡與YCA1的作用
很多應激條件和藥物能夠誘導酵母細胞凋亡，其中大部分都需要YCA1的作用。低劑量的H2O2和醋酸是最常見的誘導物[10-11]。刪除YCA1的菌株經H2O2處理比野生型存活好，蛋白酶體活力增加，減小凋亡，而過表達YCA1的細胞死亡程度增加且顯示凋亡特征，使細胞提早死亡[10]。但經400 mmol/L醋酸誘導的凋亡僅有20%~30%的caspase陽性細胞，說明這個凋亡過程與caspase有較小的相關性[11]。適當的滲透應激可使酵母細胞發生凋亡和YCA1活化，但在YCA1缺陷株中，滲透性應激后仍有微量的metacaspase激活。滲透應激過程中，YCA1激活依賴Sro77p，在缺乏SRO77的突變株中caspase活力與YCA1缺陷株的細胞相似。而Sro77p同系物Sro7p，對YCA1激活起負向作用[12]，但鹽敏感的Sro7p突變株中caspase活力比野生型高。且sro77/yca1 和 sro7/sro77/yca1突變株，仍然顯示凋亡特征，這都顯示有不依賴YCA1的凋亡路徑存在。
YCA1缺陷株經25 mmol/L丙戊酸(VPA)處理具有90%的存活率，這個濃度使野生型細胞完全致死[13]。有毒非金屬砷處理后的酵母細胞存活率YCA1缺陷株(91.3%)比野生株(50.3%)高。此外，經TUNEL染色確定DNA斷裂率在突變株(1.5%)中顯著高于野生株(34.3%)[14]。而暴露于高水平的錳(Mn)中，可致使錳中毒，Mn2+誘導的細胞凋亡通過caspase途徑[15] 。但銅誘導的凋亡不涉及YCA。咖啡因對預凋亡突變株(Kllsm4Δ1)敏感，并被同時失活的YCA1抑制[16]。
4內源誘導酵母凋亡與YCA1的作用
酵母凋亡首先被描述在CDC48基因突變細胞中，其編碼AAA-ATPase，對細胞分裂、泛素依賴的內質網相關蛋白降解和囊泡運輸起作用。在cdc48S565G突變細胞中caspase活力增加，暗示在這個突變株中，YCA1被激活[17]。缺乏功能性細胞色素C的突變株cyc1cyc7和cyc3與野生型相比，有caspase活力的細胞減少且增加存活率[18]。其他突變株也顯示凋亡表型，其中大部分YCA1作為突變誘導細胞死亡的執行者。YCA1激活也與眾多的細胞基本進程缺陷相關，如DNA復制，線粒體功能，RNA和蛋白穩定。
4.1DNA復制
當由DNA損傷藥物阿多來新誘導酵母以蛋白酶體依賴方式進行凋亡時，Cdc6p(DNA復制起始必需的預復制復合物元件)很快被降解[19]。ORC2編碼ORC和orc2-1突變細胞的一個亞基，在非許可溫度，DNA復制起始缺陷，激活DNA損傷并凋亡[20]。Orc2-1細胞凋亡誘導活性氧(ROS)產生和YCA1激活，促成orc2-1突變體死亡。ROS和YCA1的激活可能由與DNA復制叉崩潰相關的DNA損傷所誘導[20]。
4.2mRNA穩定
在酵母中，mRNA翻譯至少沿行3個蛻變路徑。其中2個是mRNAs的5′/3′核酸外切消化緊跟著一個脫蓋事件，第3個路徑中，轉錄物經3′/5′核酸外切消化被降解。在脫帽依賴路徑，mRNAs在特定的細胞質位置被降解，叫P-體，在生長過程和細胞應激后，其大小和數量改變。P-體元件(dcp1，dcp2，dhh1，lsm1-7)突變顯示凋亡表型和加速時序衰老。至少其中一個突變(Kllsm4Δ1)中，凋亡死亡依賴YCA1活力，lsm4Δ1/yca1Δ雙突變凋亡細胞減少，時序衰老過程中生存力增加[16]。
4.3蛋白穩定性
蛋白的翻譯后修飾被泛素(Ub)共價附著，這是調控細胞死亡程序的一個主要生物機制。在酵母中，泛素化與凋亡相關。事實上，通過蛋白酶體使內質網相關蛋白降解和Stm1p積聚時，需要Cdc48p，它是一種蛋白酶體底物，特異性誘導細胞死亡，當細胞缺乏Stm1p經氧化氫誘導凋亡后顯示高存活率。而UBP10的缺失，會導致細胞過早死亡，可通過刪除YCA1有效地援救此行為[21]。
5外源凋亡蛋白表達與YCA1的作用
哺乳動物凋亡蛋白在酵母中的異源表達顯示凋亡的特征，說明在酵母中有一個保守的細胞死亡程序。
僅僅caspase 8在酵母中的過表達致使細胞死亡，而caspase 3的過表達不能致死僅能抑制酵母生長。后生動物(人類，果蠅和線蟲)caspases的異源表達使酵母的原生質和核膜斷裂致使電勢降低，沒有損壞DNA。但異源caspases的作用不需要酵母凋亡自身調控者YCA1和AIF1。此外，YCA1或AIF1的缺失并沒有導致保護預凋亡蛋白Bax誘導的毒力[22-23]，所以在這里，細胞死亡可能通過自體吞噬發生。
植物和原生動物諸蟲的metacaspases在酵母中表達時，其中一些能補償YCA1的缺失。如擬南芥的2個metac-aspases(AtMCP1b and AtMCP2b)在yca1突變細胞中表達被證實在衰老過程和氧化應激誘導凋亡中被涉及[24]。來自寄生蟲碩大利什曼原蟲的單個metacaspase基因在YCA1無效突變細胞中表達能修復酵母細胞對氧化應激的敏感性，成活率水平和凋亡特征與有YCA1補助的突變細胞相似[25]。
酵母也是研究有絲分裂細胞的衰老相關退化的有用模型，如煙胺比林病理學。煙胺比林蛋白α結瘢(alpha-syn)是連接帕金森病(PD)因素之一。酵母細胞表達alpha-syn積累脂滴，顯示空泡、溶酶體缺損并顯示凋亡標志，包括磷脂酰絲氨酸外翻，細胞色素c釋放和活性氧的積累。YCA1基因的刪除廢止alpha-syn誘導的ROS積累并促進alpha-syn-表達細胞的強力生長。這些研究表明，alpha-syn-誘導的ROS產生由caspase介導，并指出alpha-syn的表達激活caspase活力，然后刺激ROS的產生并觸發凋亡[26]。
亨延頓舞蹈病由亨廷頓蛋白的特異性突變引起。亨廷頓一個聚谷氨酸(polyQ)重復擴大導致神經元中蛋白聚集，緊接著有凋亡標志的細胞死亡。在酵母中存在類似的情況，在核子中擴大polyQ聚集物積累并誘導線粒體斷裂，caspase激活和細胞死亡。雖然YCA1的缺失沒有顯著營救菌落生長中polyQ的有害效應，但聚集體的細胞內定位被強烈影響，缺失型突變體比野生型有四倍體的核定位。
6酵母凋亡過程中YCA1的分子機制
哺乳動物中，死亡受體通路和線粒體通路是導致依賴caspase凋亡的主要途徑。激活起始caspase，緊接著激活效應caspase，最后切斷細胞死亡必要的底物。caspase蛋白家族一旦被激活后便不可逆地啟動細胞死亡的執行階段。
在酵母中還沒有發現死亡受體相關類似物，但YCA1起著經典的起始caspase作用。只有人類caspase 8在酵母中異源表達有毒力，而其他的caspase異源表達無毒力。其高效斷裂對于caspase 8有高效特異性的IETD-AMC底物，而不能斷裂效應caspase3特異底物DEVD-AMC。但DEVD-VAD抑制由H2O2誘導的fis1突變株死亡，指出YCA1活力也與效應caspases相似(主要caspase3和7)。
在線粒體通路過程中，哺乳動物釋放的細胞色素C與Apaf1結合使其寡聚化，隨后pro-caspase-9復原并活化，形成的復合物被稱為“apoptosome”。caspase激活需要細胞色素C已經被很好的論證。酵母中細胞色素C的釋放最先在細胞中表達人預凋亡蛋白Bax被證實的。基于Bax表達，細胞色素C氧化酶減少和大量細胞色素C釋放到細胞質中。刪除酵母中編碼細胞色素C的2個亞型的基因雖不能廢止死亡，但能推遲酵母細胞應對一些死亡刺激[27]。
由aac1/2/3編碼的ADP/ATP 攜帶(AAC)蛋白突變株中過表達yca1并不能增加細胞死亡，因為沒有細胞色素C的釋放。高葡萄糖或山梨醇的培養基導致線粒體膨脹和細胞色素C釋放，伴隨caspase 活力增加和細胞死亡。刪除YCA1顯著營救這些表型。突變株cyc1cyc7和cyc3與野生型相比，caspase活力細胞減少且存活率增加[27]。這些發現支持在酵母YCA1激活中涉及線粒體和細胞色素C的后繼活力。然而在酵母中沒有發現哺乳動物凋亡相關因子Apaf1的同源物和相似功能的蛋白，所以酵母中細胞色素C釋放的上游機制及其如何激活YCA1仍不清楚。
與細胞色素C釋放無關的死亡通路在哺乳動物中存在且涉及EndoG和AIF1，凋亡刺激后，這2個核酸酶從線粒體定位到核中。酵母中有編碼這些蛋白的基因同源物，分別為NUC1(YJL208c)and YNR074c，這可能闡明細胞色素C和YCA1不相關的凋亡途徑[5-6]。
由過氧化氫或醋酸處理引起的酵母細胞死亡，Dnm1p啟動線粒體斷裂，進而發生細胞凋亡。刪除線粒體裂變因子FIS1可誘導細胞死亡，但刪除yca1可以廢除其作用[28]。
7結語
酵母凋亡過程的保守性及其在分子生物學研究方面的先天優勢，成為凋亡研究新的模式生物。YCA1是哺乳動物caspase的垂直同源物，在酵母細胞凋亡中具有核心作用，外源刺激，氧化壓力、衰老等多種因素導致的細胞凋亡過程中，干擾YCA1 均能避免形成凋亡表型由YCA1介導的且與線粒體相關的細胞死亡，與后生動物的內在凋亡路徑如出一轍。但含有重組體YCA1的細菌浸液顯示精氨酸、賴氨酸特異的半胱氨酸肽鏈內切酶活力，且其不被caspase z-VAD-fmk的抑制劑抑制[24]，這個表示YCA1具有一個不同于后生動物caspase的特異性位點。此外，酵母基因組可能含有除了YCA1的其他metacaspases，它們可能不能斷裂普遍被識別的caspase底物，而由其他的細胞死亡調節器起作用。
YCA1在凋亡過程中的作用及其分子機制既有保守的一面也有復雜的一面，不同的生長條件下YCA1是怎樣影響基因表達和細胞代謝仍不清楚，它的上下游通路及其作用的具體機制還不是很清楚，所以YCA1其相關物質的發掘與作用還需要更深入的研究，這樣會更了解酵母凋亡路徑和，對比高等真核生物研究，為其他物種的研究做出指導。
8參考文獻
[1] LIGR M，MADEO F，FROHLICH E，et al. Bax triggers apoptotic changes in yeast[J].FEBS Lett，1998(438):61-65.
[2] FROHLICH K U，FUSSI H，RUCKENSTUHL C.Yeast apoptosis-from genes to pathways[J].Semin. Cancer Biol，2007(17):112-121.
[3] MADEO F，HERKER E，MALDENER C，et al. A caspase-related prot-ease regulates apoptosis in yeast[J].Mol. Cell，2002(9):911-917.
[4] FAHRENKROG B，SAUDER U，AEBI U.The S. cerevisiae HtrA-like protein Nma111p is a nuclear serine protease that mediates yeast apoptosis[J].J Cell Sci，2004(117):115-126.
[5] WISSING S，LUDOVICO P，HERKER E，et al. An AIF orthologue regu-lates apoptosis in yeast[J]. J Cell Biol，2004(166):969-974.
[6] BUTTNER S，EISENBERG T，CARMONA-GUTIERREZ D，et al. End-onuclease G regulates budding yeast life and death[J]. Mol Cell，2007(25):233-246.
[7] UREN A G，O'ROURKE K，ARAVIND L A，et al. Identification of para-caspases and metacaspases:two ancient families of caspase-like proteins，one of which plays a key role in MALT lymphoma[J]. Mol Cell，2000(6):961-967.
[8] HERKER E，JUNGWIRTH H，LEHMANN K A，et al. Chronological aging leads to apoptosis in yeast[J]. J Cell Biol，2004(164):501-507.
[9] REITER J，HERKER E，MADEO F，et al. Viral killer toxins induce caspase mediated apoptosis in yeast[J].J Cell Biol，2005(168):353-358.
[10] MADEO F，FROHLICH E，LIGR M，et al. Oxygenstress: a regulator of apoptosis in yeast[J].J Cell Biol，1999(145):757-767.
[11] GUARAGNELLA N，PEREIRA C，SOUSA M J，et al. Giannattasio，YCA1 participates in the acetic acid induced yeast programmed cell death also in a manner unrelated to its caspase-like activity[J]. FEBS Lett，2006(580):6880-6884.
[12] WADSKOG I，MALDENER C，PROKSCH A，et al. Yeast lacking the SRO7/SOP1-encoded tumor suppressor homologue show increased susceptibility to apoptosis-like cell death on exposure to NaCl stress[J]. Mol Biol Cell，2004(15):1436-1444.
[13] MITSUI K，NAKAGAWA D，NAKAMURA M，et al. Valproic acid indu-ces apoptosis dependent of Yca1p at concentrations that mildly affect the proliferation of yeast[J]. FEBS Lett，2005(579):723-727.
[14] DU L，YU Y，CHEN J，et al. Arsenic induces caspase- and mitoc-hondria-mediated apoptosis in Saccharomyces cerevisiae[J]. FEMS Yeast Res，2007(7):860-865.
[15] LIANG Q，ZHOU B.Copper and manganese induce yeast apoptosis via different pathways[J].Mol Biol Cell，2007(18):4741-4749.
[16] HE Z，MA W Y，HASHIMOTO T，et al. Induction of apoptosis by caff-eine is mediated by the p53，Bax，and caspase 3 pathways[J]. Cancer Res，2003(63):4396-4401.
[17] BRAUN R J，ZISCHKA H，MADEO F，et al. Ueffing，Crucial mito-chondrial impairment upon CDC48 mutation in apoptotic yeast[J].J Biol Chem，2006(281):25757-25767.
[18] SILVA R D，SOTOCA R，JOHANSSON B，et al. Hyperosmotic stress induces metacaspase-and mitochondria dependent apoptosis in Saccharomyces cerevisiae[J]. Mol Microbiol，2005(58):824-834.
[19] CERVENY K L，TAMURA Y，ZHANG Z，et al. Regulation of mitoch-ondrial fusion and pision[J]. Trends Cell Biol，2007(17):563-569.
[20] WEINBERGER M，RAMACHANDRAN L，FENG L，et al. Apoptosis in budding yeast caused by defects in initiation of DNA replication[J].J Cell Sci，2005(118):3543-3553.
[21] BETTIGA M，CALZARI L，ORLANDI I，et al. Involvement of the yeast metacaspase Yca1 in ubp10 Delta-programmed cell death[J]. FEMS Yeast Res，2004(5):141-147.
[22] GUSCETTI F，NATH N，DENKO N. Functional characterization of human proapoptotic molecules in yeast S. cerevisiae[J]. FASEB J，2005(19):464-466.
[23] KISSOVA I，PLAMONDON L T，BRISSON L，et al. Evaluation of the roles of apoptosis，autophagy，and mitophagy in the loss of plating effi-ciency induced by Bax expression in yeast[J]. J Biol Chem，2006(281):36187-36197.
[24] WATANABE N，LAM E. Two Arabidopsis metacaspases AtMCP1b and AtMCP2b are arginine/lysine-specific cysteine proteases and activate apoptosis-like cell death in yeast[J].J Biol Chem，2005(280):14691-14699.
[25] GONZALEZ I J，DESPONDS C，SCHAFF C，et al. Leishmania major metaca-spase can replace yeast metacaspase in programmed cell death and has arginine-specific cysteine peptidase activity[J]. Int J Parasitol，2007(37):161-172.
[26] FLOWER T R，CHESNOKOVA L S，FROELICH C A，et al. Heat shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of Parkinson's disease[J]. J Mol Biol，2005(351):1081-1100.
生物學家通過對選定的生物物種進行科學研究，來揭示某種具有普遍規律的生命現象。此時，這種被選定的生物物種就是模式生物。例如果蠅，有誰會想到，這種紅眼、雙翅、羽狀觸角芒、身體分節、黃褐色的小昆蟲，在近百年間竟然能夠“成就”好幾位獲得諾貝爾獎的大科學家。
什么是自噬？
大隅良典研究的是酵母的細胞自噬機制。釀酒酵母是一種 模式生物 ，非常經典。經過20多年的研究，在酵母里已經發現了34種與自噬有關的基因。那么自噬到底是什么？當你真的了解它以后，你會發現，原來細胞這么“聰明”！
自噬，不就是自己吃自己嗎？可以這樣理解。自噬就是細胞自己降解自己結構的過程，即把一些暫時用不上的零件，拆解變成最小的模塊，然后重新組裝成自己需要的東西，這就是自噬。在植物細胞和酵母細胞里，自噬在液泡中發生。而在動物細胞里，自噬在溶酶體里發生。從一個蛋白質到整個細胞器，都是可以降解的。
自噬是細胞內分解代謝的一種途徑。除此之外還有一種途徑，稱之為泛素蛋白酶體途徑。簡單說就是在蛋白質上加個泛素，做個標記，然后送進蛋白酶體中完成消化。
發現細胞自噬
首次提出自噬這一概念的，是諾貝爾獎生理學或醫學獎獲得者、比利時細胞和生物化學家克里斯汀?德?迪夫。他在20世紀50年代通過電子顯微鏡觀察到自噬體，并在1963年溶酶體國際會議上正式提出，他也因此被譽為“自噬之父”。
到了20世紀90年代，大隅良典開始用酵母研究自噬。再后來越來越多科學家加入了研究自噬的隊伍。
細胞自噬其實分為三種方式，這是根據如何“打包”物質和如何運送物質來劃分的。
第一種叫宏自噬，也叫巨自噬，顧名思義就是自噬體比較大，用細胞膜或者其他的雙層膜去把那些不想要的東西包裹起來，然后和溶酶體融合。
第二種叫微自噬。顧名思義就是自噬體比較小，溶酶體或者液泡直接用自身去吞噬那些需要降解的東西，也許是細胞器，也許是蛋白質。
第三種叫分子伴侶介導自噬。是指分子伴侶將細胞內的蛋白質先從折疊狀態恢復為未折疊的狀態，再放到溶酶體里。
這三種方式中，第一種方式是科學家們研究最為透徹的，所以有時自噬就是指巨自噬。而酵母細胞里發生的就是巨自噬。
自噬是這樣發生的
首先，細胞核發出一種信號，指示細胞里某個部分需要降解了，或者是某些垃圾誘導細胞產生了某種反應，于是自噬發生了。
接著，自噬體逐漸擴張、收口、包裹那些垃圾。自噬體一般是球型的。
然后，自噬體和液泡或者溶酶體融合。
最后，在融合以后，細胞中那些暫時不需要的物質在某些酶的作用下便分解了，分解成氨基酸、脂肪酸之類，剩下的殘渣就排出細胞了。當然也可能暫時保留，說不定能“廢物利用”呢。
就這樣，自噬發生了。但是最初包裹那些垃圾的膜是從哪來的呢？
原來，在酵母里，膜會在自噬體“組裝”位點（這個位置是靠近液泡的），在Atg8以及其他蛋白質的作用下開始擴展生長，然后就形成了自噬體。
而在哺乳動物細胞里，這個過程就不一樣了。形成自噬體的區域是分散在整個細胞里的。第一種假說認為，自噬體膜是來自內質網的，而自噬體就形成在內質網和線粒體接觸的地方，所以還有一直說法認為自噬體膜來自線粒體外膜；還有三種假說分別認為自噬體膜來自 高爾基體、內吞體 以及細胞膜。這些假說各有證據，目前還很難說哪一個是對的，或者都是正確的，也不無可能。
高爾基體是真核細胞中內膜系統的組成之一，它由扁平膜囊、大囊泡、小囊泡三個基本成分組成。高爾基體在植物細胞中參與細胞壁的合成，但在動物細胞中它與腺細胞的分泌有很大關系。
內吞體即細胞內吞作用形成的網格蛋白有被小泡，將細胞外大分子物質攝入有被小泡，運輸到早期胞內體，在這里遇到從高爾基體轉運小泡運輸來的溶酶體水解酶，再通過晚期胞內體，進一步形成溶酶體。
自噬=凋亡？
說到這，你一定還能想到一個詞――凋亡。自噬和凋亡是一回事吧？答案是否定的。
細胞死亡分為三種：壞死、凋亡、自噬性細胞死亡。顯然，自噬和凋亡是并列存在的。
壞死就是機體受到損傷，細胞代謝停止，功能喪失。溶酶體里的水解酶釋放分解了整個細胞，或者是白細胞大老遠地跑來釋放了水解酶。
凋亡也稱為1型程序性細胞死亡。依靠的是胱冬肽酶等多種水解酶。細胞凋亡有以下特點：染色體濃聚、細胞皺縮、DNA降解和凋亡小體形成，最后殘余部分被巨噬細胞吃掉。
而自噬也叫2型程序性細胞死亡，它純粹是在溶酶體的作用下發生的，而不依賴于某些酶。
由此可見，凋亡和自噬是一種動態平衡。自噬可能比凋亡早發生，通過啟動自噬而抑制凋亡，從而保護細胞；自噬還可能向凋亡轉化。
為了更好地生存，細胞也是“蠻拼的”
細胞發生自噬是一個非常“保守”的過程，幾乎沒有進化。細胞自噬的出現是為了適應環境，尤其是碰上了“不好的年景”，比如缺乏營養、饑餓難耐，或者細胞中氧氣、水分特別少的時候，就需要自噬了。
關鍵詞：糖尿病；愈合；創面
隨著世界各國社會經濟的發展，居民生活水平的提高，由于飲食結構的改變、日趨緊張的生活節奏以及少動多坐的生活方式等諸多因素，全球糖尿病發病率及患病率增長迅速，糖尿病已經成為繼腫瘤、心血管病變之后第三大嚴重威脅人類健康的慢性疾病。糖尿病患者皮膚易受損傷，損傷后往往反復發作，遷延不愈，形成頑固難愈性潰瘍。因此，糖尿病潰瘍的治療是臨床急需解決的重要課題之一。隨著近年來分子生物學等學科的發展，對糖尿病創面愈合機制的研究也日趨深入，圍繞信號通路、血管生成、神經肽、糖基化終末產物、細胞凋亡及基質金屬蛋白酶等方面的研究逐漸成為熱點。
1信號轉導通路
創面的愈合需要多種細胞、細胞因子和細胞外基質等因素的共同參與。各因素通過細胞因子相互作用，共同協調，構成一個復雜的生物網絡。任何一種細胞因子的缺乏都可能導致創面不愈或愈合延遲。同時，細胞因子與靶細胞受體間信號轉導“失耦聯”以及多種因子間網絡調節“失控”也可能是導致創面不愈的關鍵因素。
1．1轉化生長因子β(TGFβ)與smad信號通路
TGFβ有β1～β5五個亞型，哺乳動物體內，TGFβ13是主要的三種，其中又以TGFβ1占大多數。smad蛋白家族是把TGFβ與其受體結合后產生的信號從胞質傳導到細胞核內的中介分子，各類smad蛋白相互聯系制約，并通過不同途徑參與TGFβ的信號轉導。
TGFβ1可以促進成纖維細胞的遷移、增殖，強烈趨化成纖維細胞和炎性細胞，抑制上皮細胞生長但加速血管形成，可以通過刺激成纖維細胞合成膠原等細胞外基質、抑制基質蛋白酶活性并增強膠原酶抑制劑的表達來調節ECM蛋白的表達，在創面愈合的早期TGFβ1即被釋放，傷后5～7d呈現第二個高峰。傷口愈合過程中內源性Smad3的表達、激活與炎癥反應的啟動、結束及膠原合成密切相關。
糖尿病患者潰瘍區TGFβ1正常的傷后上調反應缺失，而TGFβ3卻表達上調，可以部分地解釋其慢性難愈創面的特點；Chesnoy等［1］通過糖尿病小鼠創面皮內注射質粒DNA來轉染TGFβ1基因發現：創面的細胞增殖率和細胞外新生基質的密度、有序性排列比對照組明顯提高，且愈合時間可提前約50％。
1．2Ras信號通路
Ras信號通路在糖尿病創面愈合延遲或不愈病理機制中扮演著重要的角色，并逐漸成為研究的熱點。Ras信號通路包括如下幾部分(1)細胞外生長因子與受體偶聯；(2)受體二聚化激活；(3)絲裂原活性蛋白激酶(MAPK)級聯反應；(4)核內活化蛋白1(AP1)激活；(5)基因的轉錄和表達。
信號轉導的復雜網絡需要傳遞信號分子精確的時空排列，當脫離原本正常的細胞環境，許多轉信號分子就雜亂的相互作用。初步研究認為高糖抑制Ras信號途徑受體和其中的關鍵激酶Ras、Raf的磷酸化活化［2］，信號分子表達異常，細胞周期停滯于G0、G1期，細胞增殖的乏力可能促發凋亡，增生細胞減少，凋亡細胞增多顯然會破壞創面愈合，可能是通路失活的主要原因。
1．3Wnt信號通路
Wnt細胞信號轉導途徑是調控細胞生長、發育和分化的關鍵途徑。在腫瘤的發生、侵襲轉移、細胞黏連極性及細胞凋亡等方面成為目前的研究熱點。目前已知的Wnt作用機制有兩種：規范途徑和非規范途徑。
規范途徑:Wnt與受體卷曲蛋白Frz及低密度脂蛋白相關蛋白LRP5／6結合，胞內散亂蛋白Dsh與Frz胞內區結合后被磷酸化激活，抑制絲／蘇氨酸激酶GSK3β活性，使得βcatenin不能被磷酸化，不能被泛素蛋白酶體系統降解。不能降解的βcatenin在胞質內大量積累并進入核內，與轉錄活化因子TCF／LEF結合，啟動下游靶基因的表達。無Wnt信號刺激細胞時酪蛋白激酶I(casinekinase，CKI)將細胞質中βcatenin的Ser45磷酸化，磷酸化后的βcatenin與軸蛋白Axin，GSK3β，結腸腺瘤肉病基因蛋白APC等形成“破壞復合體”，復合體中的GSK3β相繼使βcatenin的Ser41，Thr33，Thr37磷酸化而使βcatenin能被泛素連接酶復合體E3的亞單位βTrCP(Btransducinrepeatcontainingproteins)識別，經蛋白酶體途徑降解，因而此時細胞內的βcatenin水平較低。
非規范途徑：Wnt只與Wnt受體復合物的亞基Frz作用，而不需要LRP5/6，包括Wnt/Ca2+通路和平面細胞極性信號通路。
既往在腫瘤的研究中發現：βcatenin不僅受經典的Wnt信號調控，而且受前列腺素PGE/EP2信號，表皮生長因子EGF/EGFR/PI3K/AKT，以及鈣粘蛋白Ecadherin信號調控，這些分子之間有較為復雜的crosstalk系統［3］。而目前的研究發現：高糖通過PI3KAkt信號途徑抑制內皮細胞遷移和增殖及血管發生改變，也能引起黏附分子Ecadherin的上調。ChunLiangLin等［3］報道，Wnt/βcatenin信號的上調能提高高糖導致的腎系膜細胞的活性；研究表明：Wnt以及βcatenin表達增強，表皮細胞的增殖、分化和遷移能力增強，且創面愈合加快［4，5］；皮膚角質化細胞wnt信號途徑影響創傷后皮膚的厚度及色素沉著［6］；wnt信號途徑參與保護高糖導致的血管內皮細胞的損傷［7］。
2血管生成與創面愈合
微循環障礙是糖尿病微血管病變的典型改變之一，內皮細胞結構和功能的完整是穩定微循環的關鍵。
SchrammJC等［8］發現血管內皮細胞和血管平滑肌細胞的功能障礙導致血管舒張能力減弱，使糖尿病創面有效血流灌注及物質交換減弱，前列腺素PGE1及高糖參與其中；并且發現伴有代謝綜合癥發生微血管相關病變的頻率明顯增高［9］。
在機體發生創傷后，創傷部位的新生血管給創傷部位提供氧、營養物質和生物活性蛋白，局部組織的缺血可直接影響創傷愈合的程度及其預后。它與血管內皮細胞因子（VEGF）、血管形成因子1（Ang1）、堿性成纖維細胞因子（bFGF）等細胞因子密切相關，其中VEGF是一種強效的血管生成促進因子，也是最主要的血管生成因子［10］，還具有維持血管的功能。目前，各種促血管生成因子成為臨床治療糖尿病難愈創面的研究熱點。
3創面愈合調控的神經因素
實驗研究表明，神經因素亦參與創面愈合調控的過程。正常皮膚中可表達各種類型的神經肽(neuropeptides)，這些神經肽包括P物質(sP)、生長抑素、神經肽Y(NPY)等等，參與皮膚的諸多生理功能(如代謝、免疫等)和病理變化(最重要的即創傷愈合)。
隨著神經免疫學的進展，發現神經末梢分泌的感覺神經肽P物質可能是介導機體創傷修復中神經調控的重要物質，是誘導來源于毛囊隆突部和表皮基底層的表皮干細胞（ESCs）向創緣表皮聚集、參與創傷愈合的修復信號因子。ESCs具有強大的多向分化潛能，可以形成皮膚中所有類型的細胞；Bickenbach等［11］應用Brdu／3HTdr雙標法標記并連續觀察，發現皮膚創傷后，位于毛囊膨大部的ESCs不斷增殖并通過不對稱分裂分化為TAC（短暫擴充細胞），后者遷移至創緣，促進創面愈合。但促使ESCs遷移、分化的原因還不清楚。糖尿病皮膚創緣sP濃度遠低于正常水平［12］，這可能是由于糖尿病末梢神經病變所致。目前研究發現［13］，在糖尿病大鼠背部皮膚創傷模型上觀察到外源性sP可以明顯加速糖尿病難愈傷口愈合，提高愈合質量，并且觀察到其誘導ESCs向創緣遷移，但其具體機制不清。令人感興趣的是，最近的研究提示Wnt信號通路參與皮膚發育和再生修復過程，并在表皮干細胞增殖［14］分化過程中起重要的調控作用，我們不知道其中是否存在相關性。
另外，在傷口愈合過程中感覺神經肽sP可以促進修復細胞DNA合成以及創面肌成纖維細胞的增生，且能促進肌成纖維細胞增生和新生血管形成，這可能是其促進傷口加速收縮和愈合的機制之一。
因此，神經肽通過啟動神經源性炎癥反應、誘導趨化ESCs、促進傷口收縮及血管新生，參與糖尿病創面愈合的調控過程。
4糖基化終末產物相關學說
晚期糖基化終末產物(AGEs)一直是近年來糖尿病及其各類并發癥的研究熱點，在影響創面愈合方面取得了一定的進展。糖尿病患者體內的血糖波動、胰島素敏感性降低等都可以使非酶促糖基化反應加速、AGEs水平升高，干擾內皮細胞與白細胞間的相互作用，還能使單核巨噬細胞功能受抑，分泌細胞因子的能力下降，且在創面浸潤的時間延長［15］；內皮細胞和成纖維細胞都是創面愈合過程中的主要修復細胞，兩者膜表面均存在多種AGEs結合蛋白，AGEs還可抑制內皮細胞增殖，并可以誘導其凋亡，而且與作用時間及含量相關［16］；糖基化修飾后的堿性成纖維細胞生長因子促有絲分裂的活性明顯降低，而且，AGEs還能抑制成纖維細胞合成膠原的能力［17］。
5細胞凋亡與糖尿病難愈性創面
細胞凋亡存在于創面愈合的每個階段，隨著研究的深入逐漸成為研究的新方向和熱點。Bcl2與bax是一對正負凋亡調節基因，前者抑制細胞凋亡，后者不僅本身能誘導細胞的凋亡，而且可以與前者一起調控細胞的凋亡。
糖尿病慢性潰瘍創面觀察顯示，與正常糖尿病患者皮膚相比，潰瘍創面凋亡陽性細胞數量均明顯增多。在正常細胞到潰瘍組織，bcl2含量逐漸下降而bax蛋白的表達呈增高趨勢。難愈性創面的遷延不愈不僅僅和bcl基因家族的表達有關［18］，同時還與營養、血供、細胞因子等其他因素有關：糖尿病難愈創面組織中抑癌基因p53的表達增強，下調bcl2基因的表達和上調bax基因的表達，從而增加細胞的凋亡率；糖尿病患者血中氧自由基含量明顯增高，使創面組織成纖維細胞bcl2的表達下調［19］；糖尿病難愈創面組織中高血糖可以誘導bax基因的表達增強；AGEs（糖基化終末產物）可引起氧化因素的高表達，從而引起bcl2基因的表達下調，誘發細胞凋亡的發生，創面細胞數目減少，創面難愈［20］；某些細胞因子，如IL2、IL4、IL7等可促進炎癥細胞bcl2的表達，TNFα通過抑制bcl2基因的表達，來促進凋亡。
6MMPs家族動態平衡與DM難愈性創面修復
創傷愈合是個復雜而有序的生物學過程，細胞移行、肉芽組織的形成、新生血管化以及基質的重塑均有賴于細胞外基質(extracellularmatrix．ECM)的可控性代謝。ECM的過度沉積或降解將致創面修復異常。
基質金屬蛋白酶(matrixmetaltoproteinases，MMPs)是一類具有共同生化性質的可降解ECM的鋅依賴性肽鏈內切酶，是參與ECM降解的主要蛋白酶之一。MMPs可由皮膚的多種細胞如成纖維細胞，角化細胞，巨噬細胞，內皮細胞，肥大細胞，嗜酸性細胞在特殊信號如細胞因子【腫瘤壞死因子(TNFα)，白細胞介素1β(IL1β)，IL6等】的刺激下產生。按照作用底物可以分為膠原酶，明膠酶，間質溶素，膜型MMP等。蛋白酶的激活的調控有幾種機制，包括轉錄水平，酶原激活和金屬蛋白酶組織抑制物(tissueinhibitorsofmetalloproteases，TIMPs)的調控。
慢性潰瘍的活檢和傷口滲液顯示高濃度的前炎癥因子、MMPs和低濃度的生長因子，而可愈性傷口則表現為低濃度的前炎癥因子，MMPs和高濃度的生長因子［21］。在糖尿病大鼠模型的實驗中，未受損皮膚即存在菲薄的連接組織的破壞。而Wall等［22］對糖尿病患者未受損皮膚的觀察也提示糖尿病未受損真皮成纖維細胞中MMP-2，MMP-3增高。在糖尿病難愈性創面中還出現MMP1，MMP2，MMP13水平增高的現象［23］，這可能是由于在角質細胞增殖中的MMP1的表達有助于重新上皮形成，而在愈合后期，MMP1在上皮中的過表達阻礙了基膜形成和肉芽組織形成，影響了組織重塑。在Lobmann等［23］的研究中，糖尿病難愈性創面組織中TIMP2蛋白低于對照組3倍，但由于TIMP與年齡相關，故認為MMP／TIMP的比例對反映傷口愈合情況更重要。
目前，對于糖尿病難愈性創面與MMPs關系研究的報道尚少見。MMPs在糖尿病患者創傷前后皮膚組織中時空表達異常以及MMPs／TIMP失衡可能是糖尿病創面愈合延遲的重要機制之一。
7小結與展望
隨著分子生物學、免疫學和遺傳學等實驗技術手段的不斷提高與成熟，影響創面愈合的因素正逐個被發現。這些領域的研究進展為治療糖尿病難愈性創面提供了更廣闊的思路和方式，我們可以期待在不久的將來，臨床糖尿病難愈性創面的治療必將會翻開新的一頁，取得更大的進步。
【參考文獻】
［1］ChesnoyS，LeePY，HuangL．Intradermalinjectionoftransforminggrowthfactor-betalgeneenhanceswoundhealingingeneticallydiabeticmice［J］．PharmRes，2003，20(3)：345～350．
［2］WertheimerE，SpravchikovN，TrebiczM，eta1．TheregulatlonofskinproliferationanddifferentiationintheIRnullmouse:implicationsforskincomplicationsofdiabetes［J］．Endocrinology，2001，142(3)：1234～1241.
［3］Chun-LiangLin,Jeng-YiWang,Yu-TingHuang,etal.Wnt/beta-CateninSignalingModulatesSurvivalofHighGlucose–StressedMesangialCells［J］.JAmSocNephrol,2006，17（10）：2812～2820.
［4］FathkeC,WilsonL,ShahK,KimB,HockingA,MoonR,IsikF.Wntsignalinginducesepithelialdifferentiationduringcutaneouswoundhealing［J］.BMCCellBiol，2006，7(4)：1～9.
［5］CheonSS,WeiQ,GurungA,YounA,BrightT,PoonR,WhetstoneH,GuhaA,AlmanBABeta-cateninregulateswoundsizeandmediatestheeffectofTGF-betaincutaneoushealing［J］.FASEBJ，2006，20(6):692～701.
［6］YamaguchiY,PasseronT,HoashiT,etal.Dickkopf1(DKK1)regulatesskinpigmentationandthicknessbyaffectingWnt/beta-cateninsignalinginkeratinocytes［J］.FASEBJ，2008，22(4):1009～1020.
［7］ChongZZ，ShangYC，MaieseK.VascularinjuryduringelevatedglucosecanbemitigatedbyerythropoietinandWntsignaling［J］.CurrNeurovascRes，2007，4(3):194～204.
［8］SchrammJC，DinhT，VevesA．Microvascularchangesinthediabeticfoot［J］．Theinternationaljournaloflowerextremitywounds，2006，5(3)：149～159.
［9］Abdul-GhaniM，NawafG，NawafF，ItzhakB，MinuchinO，VardiP．Increasedprevalenceofmicrovascularcomplicationsintype2diabetespatientswiththemetabolicsyndrome［J］．IsrMedAssocJ，2006，8(6)：378～382.
［10］?ZhangF，LeiMP，OswaldTM，eta1．Theeffectofvascularendothelialgrowthfactoronthehea1ingofischaemicskinwounds［J］．BrJPlastSurg，2003,56(4)：334～341.
［11］?BickenbachJR，GrinnelKL．Epidermalstemcells：interactionsindevelopmentalenvironments［J］．Diferentiation，2004，72(8)：371～380．
［12］?GibranNS，JangYC，IsikFF，eta1．Diminishedneuropeptidelevelscontributetotheimpairedcutaneoushealingresponseassociatedwithdiabetesmellitus［J］．JSurgRes，2002，108(1)：122～128.
［13］劉育杰，賴西南，王正國，等.P物質對糖尿病鼠難愈創面修復的影響及其機制的初步研究［J］.中華創傷雜志，2007，23(12)：941～944.
［14］BienzM，Beta-catenin：apivotbetweencelladhesionandWntsignalling［J］．CurrBiol，2005，15(2)：64～67.
［15］LinWD，LuSL，QingC，eta1．Therelationshipofdiabeticnon-healingwoundandAGEs［J］．ChinJClinRehab，2003，7(17)：2491～2493．
［16］LinWD，LuSL，QingC，eta1．TheinhibitioneffectofAGEsonhumanbloodvesselendothelialcells［J］．NatlMedJChina，2003，83(7)：572～576．
［17］DuraisamyY，SlevinM，SmithN，eta1．Effectofglycationonbasicfibroblastgrowthfactorinducedangiogenesisandactivationofassociatedsignaltransductionpathwaysinvascularendothelialcells：possiblerelevancetowoundhealingindiabetes［J］．Angiogenesis，2001，4(4)：277～288．
［18］GalkowskaH，OlszewskiWL，WojewodzkaU．eta1．Expressionofapoptosisandcellcycle-relatedproteinsinepidermisofvenousleganddiabeticfootulcers［J］．Surgery(StLouis)，2003，134(2)：213～220．
［19］李愛冬，張曉，羊惠君，等．糖尿病大鼠視網膜血管內皮細胞p53、bc12及生長因子的表達與細胞周期阻滯［J］．中華眼底病雜志，2003，19(1)：29～33．
［20］?林煒棟，陸樹良，青春，等．晚期糖基化終產物修飾人血清白蛋白對人血管內皮細胞的生長抑制作用［J］．中華醫學雜志，2003，83(7)：572～576．
［21］?DasuMR，BarrowRE，SpiesM．eta1．Matrixmetalloproteinaseexpressionincytokinestimulatedhumandermalfibroblasts［J］．Burns，2003，29(6)：527～531.
關鍵詞：牦牛肉；成熟；鈣激活酶；嫩度
中圖分類號：TS251.1 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）06-0001-04
肉的嫩度是所有肉品質中最重要的指標之一，它將決定肉是否被重復購買[1-2]。成熟是改善肉嫩度的有效方法之一。肉的最終嫩度取決于由內源蛋白酶引起的肌原纖維結構改變和弱化的程度，這些內源蛋白酶包括鈣激活酶、組織蛋白酶、細胞凋亡酶、蛋白酶體等[3]。目前，普遍認為，鈣激活酶在肉的嫩化中起著重要的作用[4]。骨骼肌中的鈣蛋白酶包括鈣蛋白酶1（μ-calpain）、鈣蛋白酶2（m-calpain）、鈣蛋白酶3（p94）以及鈣激活酶的內源性的專一抑制蛋白（calpastatin）[5]。
李誠等[6]研究表明，杜長大三元雜交豬的背最長肌（longissimus dorsi，LDM）、腰大肌（psoas major，PM）兩種不同部位豬肉在宰后0～4℃冷卻成熟過程中鈣蛋白酶粗酶液活性、肌原纖維小片化指數（myofibril fragmentation index，MFI）和剪切力之間呈現較高的相關性。田甲春等[7]研究發現，青海牦牛肉成熟過程中MFI 和鈣激活酶活性相關性極顯著，與組織蛋白酶L活性相關性顯著，鈣激活酶活性與組織蛋白酶L活性呈顯著負相關。郭兆斌等[8]研究了甘南牦牛肉成熟過程中食用品質、鈣激活酶粗酶活性、肌原纖維超微結構的變化規律。關于宰后牦牛肉成熟過程中μ-calpain、m-calpain及calpastatin的變化報道極少，特別是甘南牦牛肉成熟過程中μ-calpain，m-calpain及calpastatin的變化及其與嫩度指標的相關性未見報道。本實驗旨在研究甘南牦牛肉宰后成熟過程中μ-calpain、m-calpain及calpastatin的變化及其與嫩度指標的相關性，以便為構建牦牛肉嫩度的預測模型提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料及試劑
隨機選取甘南藏族自治州夏河縣，自然放牧條件下，發育正常健康無病、年齡3歲左右的黑牦牛12頭，進行屠宰，宰后牦牛的背最長肌立即被移除，分割成平均質量為50g的樣品，帶回實驗室，在0～4℃的條件下成熟0、1、3、5、7、8d，不同成熟時間點收集的樣品，一部分在-80℃的條件下冷凍用于測定鈣激活酶的活性，另一部分測定剪切力、肌原纖維小片化指數及肌纖維直徑。酪蛋白、Tris、MCE、亮肽素、PMSF、卵類黏蛋白抑制劑、EDTA均購自Sigma公司。
1.2 儀器與設備
C-LM型數顯式肌肉嫩度儀 北京陽光億事達貿易有限公司；PPS-2蛋白純化系統 上海金達生化儀器公司；XSP-8CA顯微鏡 上海光學儀器一廠。
1.3 方法
1.3.1 肌原纖維小片化指數測定
參考Kriese等[9]的方法進行測定。
1.3.2 剪切力測定
沿著肌纖維方向取厚度3cm的肉樣，在80℃水浴鍋中恒溫加熱至肉樣中心溫度達75℃，取出冷卻至室溫后，用直徑1.27cm的取樣器沿肌纖維方向鉆取3個肉柱測定樣，用嫩度儀測定剪切力值，剪切力值以N表示。每個肉樣平行測定3次，取平均值。
1.3.3 肌纖維直徑測定
參考等[10]的方法，取背最長肌的中央部位 3cm×2cm×1cm肉塊3塊，浸泡到1：10（V/V）甲醛溶液中，然后在10×40倍顯微鏡下隨機計數200根肌纖維直徑，求其平均值。
1.3.4 鈣激活酶活性的測定
1.3.4.1 酶的分離與純化
參考Delgado等[11]的方法并稍做改動。取宰后不同時間點的牦牛肉樣品，準確記錄其質量，絞碎后于4℃勻漿，加入150mL抽提液（pH8.3、100mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，10mmol/L β-巰基乙醇（MCE），100mg/L 卵類黏蛋白抑制劑，2mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），5mg/L亮抑酶肽），以勻漿3min，間隔3min模式運行，共5次。然后離心（4℃，18000×g，120min），去沉淀，取上清，并以0.45μm針式濾膜過濾。對過濾后的上清取（NH4）2SO4分級沉淀部分，用25mL勻漿緩沖液溶解沉淀部分并用25倍體積的透析液（4℃，40mmol/L Tris-HCl，pH7.35；5mmol/L EDTA；10mmol/L MCE）進行透析。透析后的溶液離心（4℃，18000×g，60min）取上清，并以0.45μm針式濾膜過濾后上柱。
DEAE-Sephacel離子交換柱（1.6cm×20cm），首先用平衡緩沖液（TEMA）（4℃，50mmol/L Tris-HCl，pH7.5；0.5mmol/L EDTA；10mmol/L MCE）進行平衡，用TEMA將雜蛋白洗脫至基線，目標蛋白用0400mmol/L NaCl的TEMA溶液進行線性梯度洗脫，流速0.5mL/min，每管3mL被收集，calpastatin在20～110mmol/L NaCl濃度的范圍被洗脫下來，μ-calpain在110～165mmol/L NaCl濃度的范圍被洗脫下來，m-calpain在220～330mmol/L NaCl濃度的范圍被洗脫下來。
1.3.4.2 鈣激活酶活性測定
參考Morton等[12]的方法。
1.4 數據處理與統計分析
用SPSS16.0對數據進行方差分析，并用Duncan 法進行多重比較。
2 結果與分析
2.1 宰后牦牛肉成熟過程中鈣激活酶活性的變化
由表1可知，在宰后牦牛肉成熟過程中，μ-calpain的活性在宰后5d之內顯著降低，5d后，μ-calpain活性變化不顯著，m-calpain的活性在宰后1d之內稍有降低，之后，變化不顯著，calpastatin的活性在宰后3d內差異不顯著，3d之后活性不斷降低。3種酶在宰后成熟過程中的變化趨勢與Delgado等[11]的報道基本一致。
μ-calpain與m-calpain需要足夠的鈣離子才能激活，激活后酶將遭受自溶，μ-calpain的自溶導致了酶的不穩定，最終導致了活力的喪失[13]。calpastatin活力的降低是由于鈣激活酶抑制蛋白多肽的降解造成的[14]。
2.2 宰后牦牛肉成熟過程中嫩度指標的變化
2.2.1 剪切力值的變化
肉的嫩度又稱為肉的柔軟性，指肉在食用時口感的老嫩，反映了肉的質地。它在本質上取決于肌纖維直徑、肌纖維密度、肌纖維類型、肌纖維完整性、肌內脂肪含量、結締組織含量及類型等[15]。肉嫩度評定最常用的方法是用嫩度儀測定剪切力，剪切力值越低，肌肉越嫩。圖1反映宰后牦牛肉在成熟8d的過程中剪切力值的變化，在宰后0～3d內，剪切力值顯著升高，在3～5d內，剪切力值顯著降低，7d后變化不顯著。最初剪切力值的逐漸增加是肌肉僵直的典型特征，隨后剪切力值的逐漸變小是逐漸成熟的過程[16]。
2.2.2 肌原纖維小片化指數
肌原纖維小片化指數是反映肌原纖維蛋白降解程度的有用標志，MFI值越大表明降解的越多，肉會變得越嫩[17]。從圖2可以看出，肌原纖維小片化指數呈現顯著增加的趨勢，在前3d增加的速度較快，3d后增加的速度有所降低，成熟5d后不再發生顯著變化。牦牛肉成熟過程中肌原纖維小片化指數的變化趨勢與Watanabe等[18]的研究結果相一致。
2.2.3 肌纖維直徑
圖3反映了宰后牦牛肉成熟過程中，肌纖維直徑的變化，在宰后0d時，肌纖維直徑為48.23μm，隨著成熟時間的延長，不斷降低，前3d變化不顯著，后5d明顯降低，但是第7天與第8天差異不顯著。
肌纖維直徑是決定肉嫩度的重要因素，肌纖維越細，肌纖維密度越大，系水力越強，表現為肉質細嫩，在成熟過程中，由于肌纖維與肌內膜發生分離及汁液的流失，導致肌纖維直徑下降[19]。
2.3 鈣激活酶與嫩度指標的相關性
表2反映了宰后牦牛肉成熟過程中，μ-calpain、m-calpain、calpastatin 3種鈣激活酶與剪切力、肌纖維直徑、MFI 3個嫩度指標之間的相關性。從表2可以看出，μ-calpain、m-calpain、calpastatin與剪切力值、MFI均呈正相關性，但是，相關性不顯著；3種酶均與肌原纖維小片化指數呈負相關，其中，μ-calpain與calpastatin呈顯著負相關（P
3 結 論
3.1 宰后牦牛肉成熟過程中，μ-calpain與calpastatin的活力顯著降低，m-calpain活力稍有降低；剪切力值先增大后減小，肌原纖維直徑顯著降低，MFI顯著增加。
3.2 μ-calpain、m-calpain、calpastatin 3種酶與剪切力值及肌纖維直徑均呈正相關，與肌原纖維小片化指數呈負相關，其中，μ-calpain與calpastatin呈顯著負相關。因此，鈣激活酶活力的變化可能導致了肌原纖維小片化指數的增加，肌原纖維的弱化和肉的嫩化，μ-calpain可能是牦牛肉嫩化的主要貢獻者。
參考文獻：
[1] MILLER M F， CARRM A， RAMSEY C B， et al. Consumer thresholds for establishing the value of beef tenderness[J]. Journal Animal Science， 2001， 79（12）： 3062-3068.
[2] MORGAN J B， SAVELL J W， HALE D S， et al. National beef tenderness survey[J]. Journal Animal Science， 1991， 69（8）： 3274-283.
[3] KEMP C M， SENSKY P L， BARDSLEY R G， et al. Tenderness-An enzymatic view[J]. Meat Science， 2010， 84（2）： 248-256.
[4] KOOHMARAIE M， GEESINK G H. Contribution of postmortem muscle biochemistry to the delivery of consistent meat quality with particular focus on the calpain system[J]. Meat Science， 2006， 74（1）： 34-43.
[5] WENDT A， THOMPSON V F， GOLL D E. Interaction of calpastatin with calpain： A review[J]. Biological Chemistry， 2004， 385（6）： 465-472.
[6] 李誠， 謝婷， 付剛， 等. 豬肉宰后冷卻成熟過程中嫩度指標的相關性研究[J]. 食品科學， 2009， 30（17）： 163-166.
[7] 田甲春， 韓玲， 劉昕， 等. 牦牛肉宰后成熟機理與肉用品質研究[J]. 2012， 43（12）： 146-150.
[8] 郭兆斌， 韓玲， 余群力. 牦牛肉成熟過程中肉用品質及結構變化特點[J]. 肉類研究， 2012， 26（2）： 8-11.
[9] KRIESE P R， SOARES A L， GUARNIERI P D， et al. Biochemical and sensorial evaluation of intact and boned broiler breast meat tenderness during ageing[J]. Food Chemistry， 2007， 104（4）： 1618-1621.
[10] ， 王存堂， 韓玲， 等. 甘南牦牛肉質特性和營養成分分析[J]. 食品科學，2010， 31（2）： 414-416.
[11] DELGADO E F， GEESINK G H， MARCHELLO J A， et al. The calpain system in three muscles of normal and callipyge sheep[J]. Journal Animal Science， 2001， 79（2）： 398-412.
[12] MORTON J D， BICKERSTAFFE R， KENT M P， et al. Calpain-calpastatin and toughness in M. longissimus from electrically stimulated lamb and beef carcasses[J]. Meat Science， 1999， 52（1）： 71-79.
[13] GOLL D E， THOMPSON V F， LI H， et al. The calpain system[J]. Physiological Reviews， 2003， 83（3）： 731-801.
[14] KOOHMARAIE M， SEIDEMAN S C， SCHOLLMEYER J E， et al. Effect of postmortem storage on Ca2+-dependent proteases， their inhibitor and myofibril fragmentation[J]. Meat Science， 1987， 19（3）： 187-196.
[15] 周光宏. 肉品加工學[M]. 北京： 中國農業出版社， 2008.
[16] THOMAS A R， GONDOZA H， HOFFMAN L C， et al. The roles of the proteasome， and cathepsins B， L， H and D， in ostrich meat tenderization[J]. Meat Science， 2004， 67（1）： 113-120.
[17] OLSON D G， PARRISH F C， STROMER M H. Myofibril fragmentation and shear resistance of three bovine muscles during post-mortem storage[J]. Journal of Food Science， 1976， 41（5）： 1036-1041
【摘要】 ：目的 研究中醫肝陽化風證和血虛生風證帕金森病患者和正常人外周血單個核細胞(PBMC)的比較蛋白質組差異。從蛋白表達水平上探討中醫肝陽化風證和血虛生風證的本質。方法 用固相pH梯度雙向凝膠電泳分離肝陽化風證和血虛生風證帕金森病患者和正常人PBMC總蛋白質，考馬斯亮藍染色，PDQuest 2-DE軟件分析，對部分差異蛋白質點進行基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)測定其膠內酶解后的肽質指紋圖譜，用Mascot查詢系統查詢SWISS-PROT數據庫。結果 獲得了分辨率和重復性均較好的雙向電泳考染圖譜，對其中的15個差異蛋白質點分別進行肽質指紋分析，經數據庫查詢，初步鑒定為一些與細胞骨架、抗氧化應激、蛋白降解、信號轉導、細胞周期調控等有關的蛋白質。結論 建立了帕金森病肝陽化風證和血虛生風證PBMC的雙向凝膠電泳圖譜，提示帕金森病肝陽化風證和血虛生風證患者和正常人的PBMC的蛋白質表達具有差異，這種蛋白質組的差異分析有助于為研究肝陽化風證和血虛生風證本質在蛋白質水平上提供物質基礎。
【關鍵詞】 肝陽化風 血虛生風 帕金森病 單個核細胞 雙向凝膠電泳 質譜
Abstract：Objective To investigate the comparative proteomes difference of PBMC between health adults and Parkinson Disease (PD) patients with Ganyang Huafeng syndrome and Xuexu Shengfeng syndrome. So to approach the essence of the two TCM syndromes from the protein expression level. Methods A series of methods， including immobilolized pH gradient two-dimensional polyacrylamide gel electrophpresis (2-DE)， Coomassie Brilliant Blue staining， PDQuest 2-DE analysis software， peptide massfingerprint based on matrix-assisted laser desorption/ionization time of flying mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) and SWISS-PROT database searching， were used to separate and indentify the proteome of PBMC between health adults and PD patients with Ganyang Huafeng syndrome and Xuexu Shengfeng syndrome. Results The good 2-DE pattern including resolution and reproducibility was obtained. After Coomassie Brilliant Blue staining， 15 spots were incised and analyzed by MALDI-TOF-MS. The typic peptide masses were searched in the SWISS-PROT database by Mascot software. All proteins were preliminarily identified， which ralated to cytoskeleton， anti-oxidative stress， protein degradation， signal transduction and cell cycle， etc. Conclusions The well-resolved， reproducible 2-DE patterns of Ganyang Huafeng syndrome and Xuexu Shengfeng syndrome PD were established and revealed the protein expression difference of PBMC between the two syndromes of PD patients. This research is helpful to provide substance evidence in investigation of the essence of Ganyang Huafeng syndrome and Xuexu Shengfeng syndrome on protein level.
Key words：Ganyang Huafeng syndrome；Xuexu Shengfeng syndrome；Parkinson Disease；PBMC；two-dimensional polyacrylamide gel electrophpresis (2-DE)；mass spectrometry
帕金森病(Parkinson Disease，PD)是中老年常見的第二大神經系統變性疾病，屬于中醫學“震掉”、“顫振”，甚至“痙病”和“肝風”的范疇，以黑質多巴胺(DA)能神經元變性缺失和路易小體(Lewy body)形成為特征。多數中醫學者認為，本病以肝腎不足為本，正虛邪戀，虛實互見，總屬本虛標實，病因繁多，病機復雜，是一個多病因、多病機參與的難治病。1991年11月，第三屆中華全國中醫學會老年腦病學術研討會通過了《中醫老年顫證診斷和療效評定標準試行草案》(以下簡稱《草案》)，將老年顫證分為痰熱動風、血瘀生風、氣血兩虛、肝腎不足、陰陽兩虛五個證型，為PD的辨證分型提供了有益的借鑒。臨床報道中有一些醫生在《草案》的基礎上又有諸多分型，如血虛生風、肝陽化風等，并依據中醫辨證論治的原則，在實踐中篩選出許多有效治療方法和方藥[1]。綜觀多年來中醫藥治療PD的醫學實踐，其療效是確切的，但也應看到仍存在諸多問題尚待解決。尤其是分型較多，且辨證分型過分強調證與證之間的區別，割裂了證與證之間的聯系。
本實驗利用雙向凝膠電泳技術對PD肝陽化風證和血虛生風證患者和正常人外周血單個核細胞(PBMC)進行比較蛋白質組學研究，獲得了較滿意的雙向電泳(2-DE)圖譜，并用PDQuest分析軟件對2-DE圖譜進行了分析，差異蛋白質點經基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)測定肽質指紋圖譜，為進一步研究PD及其辨證提供了實驗基礎。
1 對象
PD病例選擇均符合英國帕金森病腦庫臨床診斷標準[2]，中醫肝陽化風及血虛生風辨證標準參照《中醫肝臟象現代研究與臨床》中有關標準[3]。30例PD患者均來自2006年3月－2006年7月中南大學湘雅醫院神經內科門診患者。其中肝陽化風證17例，男10例，女7例，年齡36～69歲，平均(56.71±10.93)歲；血虛生風證13例，男7例，女6例，年齡50～65歲，平均(59.23±4.80)歲。正常健康志愿者(對照組)10例，來自同期中南大學湘雅醫院健康體檢中心，男女各5例，年齡49～65歲，平均(57.30±5.85)歲。各組年齡分布上無差異(P＝0.699)。均排除心、肝、腎等功能不全者，有活動性胃腸病變者，血液及內分泌系統疾病者，過敏體質者，孕期或哺乳期婦女。入選對象均簽署知情同意書。患者及正常組每人均抽取10 mL外周靜脈血，PBMC的分離參照經典的葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法制備[4]。
2 方法
2.1 固相pH梯度雙向凝膠電泳
2.1.1 細胞總蛋白質的制備
參照湘雅醫院衛生部腫瘤蛋白質組重點實驗室推薦程序制備。每EP管標本(約40～50 mg PBMC)放細胞裂解液50 μL，反復振蕩令其充分溶解(10 s/次×8次)，每次間隔10 min，離心(7 500 g×1 h，4 ℃)，吸取上清液即為細胞總蛋白質。取5 μL分裝，1.5～2 h后按BCA蛋白質定量試劑盒的微量測試法測定總蛋白質濃度。
2.1.2 雙向電泳
主要參照Amersham公司二維凝膠電泳手冊進行。IPGpH3-10NL，24 cm，采用膠內泡漲法。將含有1 mg蛋白質的各組蛋白提取液分別與IPG膠條水化液混合，進行一向等電聚焦電泳。電泳參數：30 V 13 h(水化)，依次經100 V 0.5 h、500 V 0.5 h、1 000 V 1 h、5 000 V 1 h、8 000 V >8 h(8.5 h，68 000 Vh)。等電聚焦結束后，將IPG膠條分別在含有DTT和碘乙酰胺的平衡液中各平衡15 min。將平衡后IPG的膠條移至12.5%的SDS凝膠上端，進行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳條件：每膠2.5 W/T1恒流電泳30 min后，每膠12 W/T2恒流電泳至溴酚藍離膠最底緣約1 mm處停止電泳。將凝膠置考馬斯亮藍染色液(G250＋磷酸＋硫酸銨＋甲醇＋DDH2O)中12 h后棄去考染液，雙蒸水洗滌2次后，用20%乙醇搖床洗滌脫色至背景清晰后掃描。
2.2 凝膠圖像分析
Imagescanner掃描儀掃描考染的凝膠獲取圖像，用PDQuest 2-DE分析軟件進行圖像分析。為消除誤差，將同組的三張2-DE凝膠擬合成為一張平均膠，然后進行組間比較。以正常組2-DE凝膠為參考膠，PD肝陽化風組和PD血虛生風組與之相互匹配比較，尋找差異蛋白點。
2.3 差異蛋白質點的肽質指紋分析
切下凝膠差異蛋白點，脫色，膠內酶切，檢測肽質指紋圖(PMF)。Mascot Distiller軟件檢索SWISS-PROT數據庫鑒定蛋白質。
3 結果
3.1 差異蛋白質點的MALDI-TOF-MS肽質指紋分析
選取上述15個差異表達蛋白質點經質譜分析得到PMF圖譜后，查詢SWISS-PROT數據庫，全部得到鑒定，共14種非冗余蛋白質，其功能主要與細胞骨架、抗氧化應激、蛋白降解、信號轉導、細胞周期調控等有關，具體蛋白及其在各組的變化趨勢見表1。表1 正常人及PD肝陽化風證、血虛生風證患者PBMC差異蛋白質鑒定（略）注：蛋白點的變化趨勢均以正常組為參照，同一蛋白在不同組的膠圖上進行比較，其中代表較正常組下調50%；代表下調75%以上，表示下調90%以上
3.2 雙向凝膠電泳考染圖譜及差異分析
在相同條件下對來自帕金森病和正常PBMC的總蛋白質樣品分別進行了3次雙向電泳(n＝3)。其總蛋白質的分布模式非常相似，以pI 4～8和Mr 20～60 kD范圍的蛋白質斑點分布最多。經Imagescanner圖像采集和PDQuest 2-DE分析軟件分析，在相同條件下識別的圖像分析探測到正常組PBMC的平均蛋白質點數為(700±30)個，肝陽化風證(602±15)個，血虛生風證(577±28)個，以正常組膠為參考膠進行膠間斑點匹配，其平均匹配點數肝陽化風證組為(552±16)個，平均匹配率為78.8%，血虛生風證組為(494±25)個，平均匹配率為70.6%。不同膠間蛋白質點的位置偏差在IEF方向為(2.85±0.48)mm，在SDS-PAGE方向為(2.69±0.37)mm。以上條件能滿足兩細胞間的差異蛋白質分析。采用PDQuest軟件建立同組內3張2-DE凝膠的平均膠，即計算同組內所有凝膠上的同一蛋白質點的平均表達量，某個蛋白質點的表達量是其在膠上的灰度體積(面積×灰度)。比較3組平均膠的差異(均數進行成組比較的t檢驗，P
4 討論
自Abramsky等于1978年提出免疫學異常可能是PD發病的重要影響因素之一以來[5]，近年來越來越多的研究表明，PD中樞神經變性及黑質，紋狀體損傷均與細胞免疫介導的炎癥反應密切相關[6-10]。本實驗發現PD肝陽化風證和血虛生風證PBMC的蛋白質總數和一系列蛋白質發生下調，相關功能發生減弱。
4.1 細胞骨架相關蛋白
本實驗發現，3個細胞骨架相關蛋白Talin-1、Rho GDP解離抑制因子2、CAP-1在PD肝陽化風證和血虛生風證中均有下調，而且血虛生風證下降更為明顯。Talin-1作為肌動蛋白結合蛋白，調節微絲的聚合與解聚。Rho GDP解離抑制因子2則為Rho GDI家族成員，通過結合大量的Rho GTP酶從而調節應力纖維和粘著斑的形成。而基于CAP-1的肌動蛋白絲循環是細胞運動性的主要驅動力[11]，對于細胞的發育及形態學過程，運動、內吞及囊泡運輸發揮重要作用[12]。此結果提示，在PD病理過程中發生了單個核細胞的激活以及其阿米巴運動和吞噬運動的減弱。而在PD血虛生風證中這種減弱較PD肝陽化風證更為顯著。
4.2 泛素蛋白酶系
泛素蛋白酶體系統(UPS)是體內蛋白降解的重要通路。許多研究表明，PD以及其他神經變性疾病可能是一類蛋白降解障礙疾病。F-box protein 4是SCF型E3泛素連接酶復合物底物識別組件，介導蛋白質降解，從而影響如細胞周期、信號傳導和基因表達等一系列功能。本實驗發現，PD患者PBMC中F-box protein 4下調，血虛生風證較肝陽化風證進一步下調。推測肝陽化風證與血虛生風證與泛素蛋白酶體系統(UPS)功能障礙存在聯系。
4.3 抗氧化應激酶系
氧化應激學說認為，多巴胺氧化代謝產物造成的胞內氧化壓力過盛和細胞抗氧化能力不足是PD黑質多巴胺能神經元自發退變的主要原因。硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶(Peroxiredoxin Ⅲ，PrxⅢ)屬于抗氧化蛋白Peroxiredoxin超家族，該蛋白定位于線粒體，調節細胞氧化還原，通過分生基團保護敏感酶避免氧化損傷。本實驗發現，PrxⅢ在PD肝陽化風證和血虛生風證PBMC中依次表達下調，揭示肝陽化風證和血虛生風證與PrxⅢ下降導致的氧化應激功能減弱有關。
4.4 信號轉導相關蛋白
不均一核糖核酸蛋白K(hnRNP-K)是一種核酸結合蛋白，能夠結合細胞核及線粒體的前信使RNA及單鏈DNA，作為一個轉錄因子在信號轉導、轉錄調節及細胞周期調節發揮作用，并影響線粒體的基因表達及功能。
Transgelin-2屬于鈣結合蛋白家族，以前僅在平滑肌細胞中研究較多，在淋巴細胞中很少報道。最近，Rubén Francés等發現，在腹膜B1細胞和被刺激的脾臟B2細胞中表達，并推測其作用機制為通過限制肌動蛋白的解聚作用從而調整BCR信號傳導來激活該類細胞[13]。我們研究發現，hnRNP-K和Transgelin-2在PD肝陽化風證和血虛生風證PBMC中表達下調，血虛生風證中下降更為明顯，提示在肝陽化風和血虛生風證中發生了細胞信號轉導障礙。
4.5 Ras相關蛋白
另外，本實驗發現，Rap1b蛋白和Ras抑制蛋白1(Rsu-1)兩種Ras相關蛋白在PD肝陽化風證和血虛生風證中表達相繼下降，Rap1b蛋白定位于細胞膜、脂錨、細胞質側，是RAP1的主要異構體[14]。很多研究表明，Rap信號能夠調整多種細胞過程包括細胞分化和粘附。而Ras抑制蛋白1(Rsu-1)在真核生物中的各種細胞和組織中廣泛存在，作用于Ras 信號傳導途徑。Masuelli L等[15]研究提示，Rsu-1能夠通過Ras途徑激活神經生長因子，加速細胞分化。兩種Ras相關蛋白在PD肝陽化風證和血虛生風證PBMC中表達相繼下調，表明兩證的發生與Ras相關的細胞分化障礙有關。
4.6 多功能蛋白酶
磷脂酰乙醇胺結合蛋白1(PEBP-1)是一種高度保守的絲氨酸蛋白酶抑制劑，在各種組織特別是神經組織中廣泛存在。有學者發現，hPEBP家族中的hPEBP4通過抑制MAPK途徑的活化[16]及磷脂酰乙醇胺的分泌從而對抗TNF-α誘導的細胞凋亡[17]。PEBP的N端片斷能夠轉化為海馬膽堿能神經刺激肽HCNP，可能涉及到中樞海馬區的發育成熟和中樞神經系統的突觸前膽堿能神經元的功能[18]。Cyclophilin A是一種普遍存在且含量豐富的胞溶質蛋白，系免疫抑制劑環胞霉素A的作用靶，具有肽酰-脯氨酰-順反式異構酶(PPIase)活性，保證蛋白質的正確的空間折疊。一直以來，人們對于PPIase的研究主要集中在其介導的免疫抑制作用。但Gold[19]發現，同樣具有PPIase活性的FKBP12在神經系統中的含量比在免疫系統中要高出50倍以上，其介導的FK506在體內外均可以促進神經再生。另有學者認為，Cyclophilin A是一種氧化應激誘導分泌的生長因子[20]。本實驗發現，PD患者PBMC中PEBP-1和Cyclophilin A這兩種抗凋亡和促進細胞生長的蛋白表達下降與帕金森病的神經退行性變是否存在聯系值得進一步的探討，對肝陽化風證和血虛生風證的本質有提示作用。
綜上所述，PD肝陽化風證和血虛生風證PBMC中蛋白質數目下降和相關蛋白表達的改變導致PBMC的阿米巴運動和吞噬運動、抗氧化應激、蛋白降解、信號轉導、生長分化、抗凋亡等功能均發生了不同程度的減弱，且PD血虛生風證下降較肝陽化風證更為顯著。中醫理論認為，肝陽化風和血虛生風同屬肝風內動，其根本病機為肝腎陰虛，陰不制陽則陽亢化風，久病也可由肝血虧虛而誘發肝風內動，兩者之別在于肝陽化風證為虛中夾實，血虛生風證則為虛中之虛。結合本實驗，我們認為，肝腎陰虛肝風內動則PBMC相關功能發生減弱，肝陽化風證虛中挾實，PBMC功能減弱并不顯著，機體尚能調節自身正氣；久病機體正氣愈傷，生血虛生風證為虛中之虛，PBMC功能進一步減退。研究結果在蛋白質水平上支持兩證上述中醫理論，為兩者病機的聯系及區別提供了物質基礎。
【參考文獻】
[1] 黃俊山.震顫麻痹辨證體會[J].實用中西醫結合雜志，1996，9(1)：8.
[2] Hughes AJ， Daniel SE， Kilford L， et al. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson’s disease：a clinicopathological study of 100 cases[J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry，1992，55：181－184.
[3] 金益強.中醫肝臟象現代研究與臨床[M].北京：人民衛生出版社，2000. 235－240.
[4] 陳肅標，謝素和，曾慶馀.提高外周血淋巴細胞梯度離心分離率[J].汕頭大學醫學院學報，2001，14(2)：135－137.
[5] Abramsky O， Litvin Y. Automimmune response to dopamine-receptor as a possible mechanism in the pathogenesis of Parkinson’s disease and schizophenia[J]. Perspect Biol Med， 1978，22(1)：104－114.
[6] Bessler H， Djaldetti R， Salman H， et al. IL-1 beta， IL-2， IL-6 and TNF-alpha production by peripheral blood mononuclear cells from patients with Parkinson’s disease[J]. Biomed Pharmacother， 1999，53(3)：141－145.
[7] Josefsson E， Bergquist J， Ekman R， et al. Catecholamines are synthesized by mouse lymphocytes and regulate function of these cells by induction of apoptosis[J]. Immunology，1996，88(1)：140－146.
[8] Bieganowska K， Czonkowska A， Korlak J. Pargyline pretreatment prevents immunological changes induced by MPTP in mice[J]. Immunopharmacology，1996，35(2)：149－154.
[9] Kurkowska-Jastrzebska I， Wrońska A， Kohutnicka M， et al. The inflammatory reaction following 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6- tetrahydropyridine intoxication in mouse[J]. Exp Neurol，1999， 156(1)：50－61.
[10] O’Callaghan JP， Miller DB， Reinhard JF. Characterization of the origins of astrocyte response to injury using the dopaminergic neurotoxicant， 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine[J]. Brain Res，1990，521(1-2)：73－80.
[11] Moriyama K， Yahara I. Human CAP1 is a key factor in the recycling of cofilin and actin for rapid actin turnover[J]. J Cell Sci，2002， 115(Pt 8)：1591－1601.
[12] Bertling E， Hotulainen P， Mattila PK， et al. Cyclase-associated protein 1 (CAP1) promotes cofilin-induced actin dynamics in mammalian nonmuscle cells[J]. Mol Biol Cell，2004，15(5)：2324－2334.
[13] Francés R， Tumang JR， Kaku H， et al. B-1 cells express transgelin 2： unexpected lymphocyte expression of a smooth muscle protein identified by proteomic analysis of peritoneal B-1 cells[J]. Mol Immunol，2006，43(13)：2124－2129.
[14] Klinz FJ， Seifert R， Schwaner I， et al. Generation of specific antibodies against the rap1A， rap1B and rap2 small GTP-binding proteins. Analysis of rap and ras proteins in membranes from mammalian cells[J]. Eur J Biochem，1992，207(1)：207－213.
[15] Masuelli L， Ettenberg S， Vasaturo F， et al. The ras suppressor， RSU-1， enhances nerve growth factor-induced differentiation of PC12 cells and induces p21CIP expression[J]. Cell Growth Differ， 1999，10(8)：555－564.
[16] Yeung K， Seitz T， Li S， et al. Suppression of Raf-1 kinase activity and MAP kinase signalling by RKIP[J]. Nature，1999， 401(6749)：173－177.
[17] Wang X， Li N， Liu B， et al. A novel human phosphatidylethanolamine- binding protein resists tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis by inhibiting mitogen-activated protein kinase pathway activation and phosphatidylethanolamine externalization[J]. J Biol Chem，2004，279(44)：45855－45864.
[18] Banfield MJ， Barker JJ， Perry AC， et al. Function from structure? The crystal structure of human phosphatidylethanolamine-binding protein suggests a role in membrane signal transduction[J]. Structure，1998，(10)：1245－1254.
