時(shí)間：2023-06-01 09:31:10
開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創(chuàng)造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，希望這些內(nèi)容能成為您創(chuàng)作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進(jìn)步。
【摘要】
目的分析naa的濃度（50，150，300 mg·l-1）、處理時(shí)間（10，20，30 s）和不同基質(zhì)配比（泥炭和珍珠巖比例為1∶1，1∶2，1∶3）對(duì)白術(shù)嫩枝扦插的生根影響。方法采用3因素3水平l9（34）正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行試驗(yàn)處理，利用方差分析和公式分析法確定最優(yōu)扦插方案。結(jié)果試驗(yàn)中白術(shù)嫩枝扦插最高成活率和生根率達(dá)80.00%。結(jié)論naa濃度為150 mg·l-1，處理時(shí)間為10 s，泥炭和珍珠巖配比為1∶3的處理組合利于白術(shù)嫩枝扦插生根，實(shí)驗(yàn)方案適用于浙北主產(chǎn)區(qū)白術(shù)的嫩枝扦插。
【關(guān)鍵詞】 術(shù) 嫩枝扦插 naa濃度 基質(zhì) 生根率 正交實(shí)驗(yàn)
白術(shù)atractylodes macrocephala koidz.為菊科多年生草本，以地下根莖入藥，是常用的補(bǔ)氣中藥，具有補(bǔ)脾、健胃、化濕、止瀉等功能。白術(shù)含揮發(fā)油，油中主要成分為蒼術(shù)酮、蒼術(shù)醇、白術(shù)內(nèi)酯等［1］。 現(xiàn)代 藥理研究表明，白術(shù)具有利尿、降低血糖等功效，對(duì)放化療所引起的白血球下降具有回升作用（生白）［2］。
白術(shù)主產(chǎn)于浙江、江蘇、安徽，是“浙八味”之一，為著名的地道藥材。wwW.133229.cOM由于目前白術(shù)品質(zhì)混雜、病蟲害發(fā)生嚴(yán)重，因此較多的研究選擇以抗病性強(qiáng)、株型良好的白術(shù)作為研究對(duì)象，利用葉片或側(cè)芽進(jìn)行組織離體快繁［3～6］，但葉片的愈傷組織誘導(dǎo)和分化率不高，并且成本高，不便于推廣。本研究從多年栽培研究中選育出植株矮化、葉色深綠、抗病能力強(qiáng)的薯葉型植株作為材料，對(duì)其嫩枝進(jìn)行扦插繁殖，通過正交實(shí)驗(yàn)研究分析激素濃度、扦插處理時(shí)間和基質(zhì)對(duì)白術(shù)嫩枝生根的影響，以期取得最佳白術(shù)嫩枝扦插穗條件，從而獲得更多性狀穩(wěn)定、無病害感染的白術(shù)幼苗，為白術(shù)的栽培提供優(yōu)良的種質(zhì)資源。
1 材料
1.1 試劑本研究選用由sigma公司生產(chǎn)的分析純naa作為扦插激素，用去離子水配置濃度為50，150，300 mg·l-1溶液，供扦插使用。
1.2 扦插基質(zhì)本研究采用泥炭和珍珠巖混勻作為插床基質(zhì)，泥炭和珍珠巖配比（體積比）依次為1∶1，1∶2和1∶3。試驗(yàn)前24 h用50 %多菌靈800倍液噴灑消毒，用塑料膜覆蓋，備用。
1.3 插穗培育于2007年在白術(shù)地塊選定薯葉型植株掛牌，留作種用。200802挖出，選擇大小相似、無病蟲害及機(jī)械損傷的健康根莖，用50％多菌靈800倍液浸泡10 h，移栽到浙江林學(xué)院百草園中。按照常規(guī)的種植要求，耕深25 cm，土粒小于1 cm，施腐熟雞糞作為底肥，做高20 cm、寬100 cm、步道底寬25 cm的苗床。株行距20 cm×30 cm，每行開溝深10 cm，墊6 cm焦泥灰，栽5株。栽苗2 cm深，焦泥灰蓋滿行，上面覆蓋茅草等蓬松物料，用以遮擋大雨以及保濕。待白術(shù)嫩枝生長(zhǎng)至15～20 cm時(shí)供采穗扦插試驗(yàn)用。
2 方法
2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用3 因素3 水平的正交實(shí)驗(yàn)，正交表選用l9（34）。3個(gè)因素分別是a（激素濃度：50，150，300 mg·l-1），b（處理時(shí)間10，20，30 s），c（基質(zhì)配比，泥炭和珍珠巖體積比為1∶1，1∶2，1∶3）。見表1。表1 正交實(shí)驗(yàn)l9 （略）
2.2 扦插試驗(yàn)于200804進(jìn)行，在采穗圃切取白術(shù)莖段，去除葉片以減少插穗水分蒸騰散失，切成7 cm左右插穗，按上、下切口分開擺齊，放置傷口微干。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)處理白術(shù)嫩枝，每個(gè)處理為30株插穗。處理后直接扦插，為避免擦傷插穗皮層，采用玻璃棒引洞。插穗的株行距為5 cm×10 cm，插入基質(zhì)深度約2～3 cm，壓實(shí)。
扦插后建塑料小拱棚保溫保濕（見表2）。每天早晚噴水各1次，中午揭開薄膜以通風(fēng)透氣。扦插后16 d去膜，改用遮陽網(wǎng)遮蔭，透光率在20%左右，噴水1 次/d，防止新生根腐爛。表2 環(huán)境溫度和濕度（略）
2.3 調(diào)查扦插1周后開始調(diào)查，每?jī)商?次，調(diào)查項(xiàng)目包括：愈傷組織產(chǎn)生時(shí)間（d）、不定根產(chǎn)生時(shí)間（d）、插穗存活率（%）、生根率（%）、假性成活率（%）、根數(shù)（條）、根長(zhǎng)（cm）等。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
3 結(jié)果與分析
3.1 試驗(yàn)結(jié)果通過l9（34）試驗(yàn)，對(duì)各處理組白術(shù)嫩枝存活率、生根率、根數(shù)、根長(zhǎng)等的調(diào)查結(jié)果列于表3。表3 白術(shù)嫩枝扦插生根正交試驗(yàn)結(jié)果（略）
3.1.1 激素處理對(duì)于白術(shù)生根的影響從表3可見，用naa處理白術(shù)插穗均能誘導(dǎo)生根，但濃度不同生根率亦不同，其中5號(hào)處理（濃度為150 mg·l-1）的白術(shù)插穗存活率和生根率最高，均為80.00%。而且，在一定濃度范圍內(nèi)（50 ～150 mg·l-1），白術(shù)嫩枝的扦插生根率隨naa的濃度升高呈升高趨勢(shì)（平均生根率分別為64.44%和67.78%），有低濃度促進(jìn)的特點(diǎn)，但當(dāng)naa濃度為300 mg·l-1時(shí)，生根率反而呈下降趨勢(shì)（平均生根率為40.00%），表現(xiàn)出高濃度抑制，與夏鐵騎［7］、許紅艷等［8］的研究結(jié)果近似。
在調(diào)查白術(shù)插穗愈傷組織形成和生根情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，各種處理水平的白術(shù)插穗均為首先在切口形成愈傷組織，然后在愈傷組織上面形成不定根。由表3可知，naa濃度為50 mg·l-1和150 mg·l-1時(shí)，愈傷組織形成時(shí)間較早，有利于提早發(fā)根。2號(hào)～7號(hào)處理形成愈傷組織的時(shí)間均為16 d，8號(hào)處理時(shí)間最長(zhǎng)，為26 d；不定根由愈傷組織上長(zhǎng)出，發(fā)根時(shí)間最短者為5號(hào)和7號(hào)處理，為19 d，發(fā)根時(shí)間最長(zhǎng)者為8號(hào)處理，為30 d。
3.1.2 基質(zhì)配比對(duì)于白術(shù)生根的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表3）表明，基質(zhì)配比對(duì)白術(shù)插穗生根產(chǎn)生明顯影響：4號(hào)處理平均根數(shù)高于其他處理，為22條；其發(fā)根數(shù)亦為最多，為43條，明顯高于其他處理。最長(zhǎng)根長(zhǎng)的處理組合為3號(hào)試驗(yàn)，為6.2 cm。
白術(shù)生根指標(biāo)隨泥炭和珍珠巖的配比水平增加而呈 規(guī)律 性變化：愈傷組織形成平均時(shí)間（21.33 ,17,16 d）和不定根形成平均時(shí)間（27.33，26，21.33 d）遞減，平均根數(shù)（為10.67條，13.33條，14.33條）、平均最多發(fā)根數(shù)（為19條、27.33條、31.33條）和平均最長(zhǎng)根長(zhǎng)（為2.07，3.90，4.03 cm）呈遞增趨勢(shì)，與張雪平［9］實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。
3.1.3 處理時(shí)間對(duì)于白術(shù)生根的影響處理時(shí)間對(duì)扦插生根有一定影響，由于試驗(yàn)材料為白術(shù)未木質(zhì)化的嫩枝，所以選擇處理的時(shí)間為快速處理，防止naa各濃度造成白術(shù)嫩枝脫水，影響生根率和成活率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10 s和20 s的處理時(shí)間，生根效果較好。生產(chǎn)中選用低濃度長(zhǎng)時(shí)間處理和高濃度快速處理，一般大面積扦插以后者居多［10］。
3.2 統(tǒng)計(jì)分析在扦插過程中，多數(shù)研究?jī)H以生根率作為最終指標(biāo)，但應(yīng)同時(shí)考慮其他輔助指標(biāo)的作用，從而綜合優(yōu)化出最佳扦插方案。根據(jù)苑玉鳳［11］的多指標(biāo)正交試驗(yàn)分析方法，本研究采取排隊(duì)評(píng)分與公式評(píng)分法對(duì)幾個(gè)主要指標(biāo)打分后進(jìn)行分析。
首先，排隊(duì)評(píng)分。根據(jù)表3，生根率指標(biāo)以5號(hào)處理最高（80.00%），排在第一，定為10分；8號(hào)最低（30.00%），排在最后，定為1分；平均根數(shù)以4號(hào)處理最多（22條），為10分；9號(hào)處理最少（7條），為1分；生根時(shí)間以5號(hào)和7號(hào)處理最短（19 d），為10分；8號(hào)處理時(shí)間最長(zhǎng)（30 d），為1分。其它處理各指標(biāo)的得分根據(jù)其與該指標(biāo)優(yōu)秀值的差異按比例 計(jì)算 得出。
其次，公式評(píng)分。在本試驗(yàn)中，生根率指標(biāo)最重要，以5倍計(jì)算，即權(quán)數(shù)為5；平均根數(shù)指標(biāo)次之，以3倍計(jì)算，即權(quán)數(shù)為3；生根時(shí)間以2倍計(jì)算，即權(quán)數(shù)為2。所以其評(píng)分公式為：評(píng)分= 5×生根率+ 3×平均根數(shù)+2×生根時(shí)間。對(duì)各處理所有指標(biāo)的分?jǐn)?shù)根據(jù)公式乘以加權(quán)系數(shù)，相加即得綜合評(píng)分，見表4。表4 公式評(píng)分法結(jié)果數(shù)據(jù)（略）
由表4所示，在9個(gè)處理中，經(jīng)過排隊(duì)評(píng)分和公式評(píng)分后，得出4號(hào)處理綜合評(píng)分最高，為85.55，即實(shí)驗(yàn)條件為 a2b1c2，5號(hào)處理次之。
由表4對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行方差分析，得出表5，可以看出，因素a（激素）和c（基質(zhì)配比）在α=0.05的置信區(qū)間內(nèi)具有顯著性。表5 公式評(píng)分法的方差分析（略）
依據(jù)每個(gè)處理的綜合評(píng)分進(jìn)行極差分析，如表6所示，因素主次順序?yàn)閏、a、b，較佳方案是a2b1c3，即naa濃度為150 mg·l-1，處理10 s，選取泥炭和珍珠巖體積比為1∶3的基質(zhì)。表6 公式評(píng)分法極差分析（略）
4 討論
4.1 白術(shù)扦插不定根的形成機(jī)制植物扦插生根分為兩類，一是由潛伏根原基形成的不定根，即皮部生根；二是由離體誘導(dǎo)產(chǎn)生的根原基形成的不定根，即切口生根。誘生根原基常生于插穗下部的愈傷組織，即在適宜條件下由插穗基部形成的一團(tuán)不規(guī)則的、具有不同木質(zhì)化程度的薄壁細(xì)胞，起源于維管形成層部位的幼嫩細(xì)胞，皮層和髓部的各種細(xì)胞也可能參與愈傷組織的形成［12］。通過本次試驗(yàn)調(diào)查數(shù)據(jù)得出（見表3），各種處理水平的白術(shù)插穗均首先形成愈傷組織，之后在愈傷組織上分化發(fā)根，未見由插穗的皮部發(fā)根情況，因此認(rèn)為白術(shù)插穗生根屬于第二種生根類型，即以愈傷組織生根為主。
也有人認(rèn)為，naa對(duì)扦插生根的效果比較明顯，其主要機(jī)理為naa 能促進(jìn)插穗貯存的淀粉水解為還原糖，作為呼吸底物，為不定根的形成提供較豐富的能源和碳源，從而促進(jìn)不定根形成［13］。
4.2 假性成活扦插成活的關(guān)鍵是插穗能否產(chǎn)生和形成不定根。許多試驗(yàn)證實(shí)，外源激素對(duì)插穗產(chǎn)生不定根具有促進(jìn)作用［14,15］。本實(shí)驗(yàn)中存活率和生根率存在差異，因此將扦插過程中只有愈傷組織但無不定根的成活苗現(xiàn)象稱為假性成活［16］。由表3可以看出，除4號(hào)和5號(hào)處理無假性成活外，其他處理假性成活率為3.33%～10%。分析認(rèn)為，愈傷組織和不定根的形成是各自獨(dú)立的過程，即在愈傷組織中不一定能分化并形成不定根［12］。如果愈傷組織過于發(fā)達(dá)，不定根無法從膨大且緊密的愈傷組織處發(fā)出，推遲生根時(shí)間，甚至不能發(fā)根［17］，即成為假性成活苗。作者在以市售生根粉國(guó)光生跟（含20% naa）為激素對(duì)白術(shù)進(jìn)行嫩枝扦插處理時(shí)觀察到，由切口處只形成膨大的愈傷組織，但不產(chǎn)生不定根（另文報(bào)道）。假性成活苗由于長(zhǎng)時(shí)間無法從膨大的愈傷組織上產(chǎn)生不定根，最終導(dǎo)致死亡。因此，降低假性成活率對(duì)于提高扦插生根成活至關(guān)重要。
4.3 基質(zhì)對(duì)生根的影響本研究結(jié)果表明，泥炭和珍珠巖體積比為1∶3的基質(zhì)為插穗生根提供了良好的條件，分析認(rèn)為基質(zhì)中泥炭容重較大，蓄水、保水能力強(qiáng)，而珍珠巖疏松多孔，容量小，毛管孔度、通氣孔度均大于泥炭。二者體積比不同，基質(zhì)結(jié)構(gòu)中的總孔度、毛管孔隙不同，基質(zhì)中的水分含量和通氣能力不同，誘導(dǎo)發(fā)根能力因而不同。白術(shù)喜肥沃的砂質(zhì)壤土，如果土壤過黏，會(huì)因透氣性差引發(fā)病害及爛根現(xiàn)象［18］。本試驗(yàn)地點(diǎn)選在浙江臨安，屬于亞熱帶濕潤(rùn)型季風(fēng)氣候，且試驗(yàn)時(shí)間為春夏之交，陰雨天氣較多，空氣和土壤濕度比較大，容易引起插穗腐爛。因此在浙北地區(qū)春季對(duì)白術(shù)進(jìn)行嫩枝扦插時(shí)，泥炭和珍珠巖為1∶3的基質(zhì)配比為最佳選擇。
本研究采用正交設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)于反映白術(shù)嫩枝扦插時(shí)激素的濃度、基質(zhì)的配比、處理時(shí)間與插穗下端產(chǎn)生愈傷組織、生根的關(guān)系以及選擇最佳處理方案，是十分有效的工具。本研究通過9種處理，對(duì)生根率、平均根數(shù)、生根時(shí)間等多項(xiàng)指標(biāo)綜合考慮，減少實(shí)驗(yàn)工作量，基本反映全部組合的效果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)得出，在浙北地區(qū)春季，以naa為激素對(duì)白術(shù)進(jìn)行嫩枝扦插時(shí)最佳方案是：naa濃度150 mg·l-1，處理時(shí)間10 s，泥炭∶珍珠巖體積比為1∶3。
【 參考 文獻(xiàn) 】
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1 考綱解讀
1.1考綱要求
(1)孟德爾遺傳實(shí)驗(yàn)的科學(xué)方法Ⅱ；
(2)基因的分離定律和自由組合定律Ⅱ；
(3)基因與性狀的關(guān)系Ⅱ；
(4)伴性遺傳Ⅱ。
2010年與2011年對(duì)比，考綱要求相同。即要求學(xué)生能在較復(fù)雜的情境中綜合運(yùn)用其進(jìn)行分析、判斷、推理和評(píng)價(jià)，屬于理解、應(yīng)用水平。
1.2能力要求
(1)理解與綜合運(yùn)用能力：能運(yùn)用所學(xué)知識(shí)與觀點(diǎn)，通過分析與綜合等方法對(duì)某些生物學(xué)問題進(jìn)行解釋、推理，作出合理的判斷或得出正確的結(jié)論。
(2)實(shí)驗(yàn)與探究能力：具備驗(yàn)證簡(jiǎn)單生物學(xué)事實(shí)的能力并能對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果進(jìn)行解釋、分析和處理，能對(duì)一些簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)方案作出恰當(dāng)?shù)脑u(píng)價(jià)和修訂。
2 教學(xué)目的
遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)類習(xí)題高考的頻率比較高，而且分值還比較大，但部分學(xué)生總是把握不好。本節(jié)課針對(duì)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)題的相關(guān)類型進(jìn)行解法指導(dǎo)及例題來展開教學(xué)復(fù)習(xí)，以便使學(xué)生更好地解決遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)題，增加得分率。
3 教學(xué)重點(diǎn)
(1)熟悉相對(duì)性狀中顯、隱性關(guān)系判斷的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
(2)探究某性狀的遺傳是細(xì)胞核遺傳還是細(xì)胞質(zhì)遺傳。
(3)掌握基因在常染色體還是x染色體上判定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
(4)了解環(huán)境因素和遺傳因素對(duì)生物性狀影響的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
4 教學(xué)難點(diǎn)
相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的解題方法及例題分析。
5 教學(xué)用具
多媒體課件。
6 教學(xué)流程
6.1探究一：相對(duì)性狀中顯、隱性關(guān)系判斷的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
6.1.1解題方法
方案一：自交。
(1)若自交后代出現(xiàn)性狀分離，則親本性狀為顯性，新出現(xiàn)性狀為隱性；
(2)若子代全部表現(xiàn)為親本性狀，可認(rèn)定它們都是純合子，再讓它們進(jìn)行雜交，其后代表現(xiàn)出的性狀為顯性，未表現(xiàn)出的性狀為隱性。
方案二：雜交。
(1)若后代出現(xiàn)某一親本性狀，則該性狀為顯性性狀，另一性狀為隱性性狀；
(2)若后代表現(xiàn)出兩種親本性狀，可再進(jìn)行自交，出現(xiàn)性狀分離的為顯性性狀，未出現(xiàn)性狀分離的為隱性性狀。
6.1.2例題
經(jīng)鑒定，玉米的紅粒與黃粒是一對(duì)相對(duì)性狀，且為常染色體完全顯性遺傳。請(qǐng)你用某株玉米果穗上的紅粒與黃粒為實(shí)驗(yàn)材料設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以鑒定這一相對(duì)性狀的顯隱性關(guān)系。
解題環(huán)節(jié)：__________________。
確定方法或思路：_________________。
預(yù)期結(jié)果、得出結(jié)論：_________________。
解析：
方案一：自交。若子代全部表現(xiàn)為黃粒或紅粒，可認(rèn)定黃粒或紅粒為純種；若讓子代的黃粒和紅粒雜交，其后代表現(xiàn)出的性狀為顯性，未表現(xiàn)出的性狀為隱性；若自交后代出現(xiàn)性狀分離，則親本性狀為顯性，新出現(xiàn)的性狀為隱性。
方案二：雜交。若子代表現(xiàn)出某一親本性狀，則該性狀為顯性性狀，另一性狀為隱性性狀；若后代表現(xiàn)出兩種親本性狀，可再進(jìn)行自交，出現(xiàn)性狀分離的為顯性性狀，未出現(xiàn)的性狀為隱性性狀。
設(shè)問：根據(jù)所學(xué)知識(shí)，還有沒有其他方法來解決該題?
提示：采用單倍體育種后，再雜交即可。
6.1.3學(xué)生感悟
顯性性狀和隱性性狀的判斷方法：
(1)自交：讓具有相對(duì)性狀親本分別自交，看其后代有無性狀分離，若有則親本的性狀為顯性性狀。
(2)雜交：讓具有相對(duì)性狀的兩親本雜交，觀察后代的表現(xiàn)型，若后代只表現(xiàn)一種親本性狀，則此性狀為顯性性狀。
(3)隱性性狀的親本自交后代都是隱性性狀。
6.2探究二：判定細(xì)胞核遺傳與細(xì)胞質(zhì)遺傳的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
6.2.1細(xì)胞質(zhì)遺傳與細(xì)胞核遺傳的區(qū)別(表1)
6.2.2區(qū)別細(xì)胞質(zhì)遺傳與細(xì)胞核遺傳的方法(正交和反交)
(1)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：隱性的雌性×顯性的純合雄性；
顯性的純合雌性×隱性的雄性。
(2)結(jié)果預(yù)測(cè)及結(jié)論：
①若兩組雜交結(jié)果相同，則該基因位于細(xì)胞核內(nèi)的常染色體上：
正交：aa×AA－Aa；
反交：AA×aa－Aa。
②若兩組雜交結(jié)果不同，且子代性狀表現(xiàn)都與相應(yīng)母本性狀相同，則該基因位于細(xì)胞質(zhì)中：
正交：H×L－H；
反交：L×H－L。
③若兩組雜交結(jié)果不同，且子代性狀的表現(xiàn)與性別相關(guān)，一種情況子代與母本性狀一致，另一種情況子代雌性與父本性狀一致，子代雄性與母本性狀一致，則該基因位于細(xì)胞核內(nèi)的x染色體上：
正交：XaXa×XAY－XAXa、XaY；
反交：XAXA×XaY－XAXa、XAY。
6.2.3例題
如圖1所示系譜的陰影部分表示患者家族性疾病的個(gè)體。據(jù)圖可知Ⅳ1攜帶致病基因的概率以及與Ⅲ4個(gè)體既非直系血親，又非三代以內(nèi)旁系血親的異性個(gè)體分別是( )
A 1／2和Ⅱ1，Ⅱ3
B 0和Ⅱ1，Ⅲ3
C 2／3和Ⅲ2，Ⅲ3
D 1／8和Ⅲ8，Ⅱ6
答案：B。
6.2.4學(xué)生感悟
判定細(xì)胞核遺傳與細(xì)胞質(zhì)遺傳的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
正交、反交法。
6.3探究三：判斷基因位于常染色體上還是位于X染色體上的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
6.3.1解題方法
(1)方法一：
①實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：隱性的雌性×顯性的純合雄性，
顯性的純合雌性×隱性的雄性。
②結(jié)果預(yù)測(cè)及結(jié)論：
A 若兩組雜交結(jié)果相同，則該基因位于細(xì)胞核內(nèi)的常染色體上：
正交：aa×AA－Aa；
反交：AA×aa－Aa。
B 若兩組雜交結(jié)果不同，且子代性狀的表現(xiàn)與性別相關(guān)，一種情況子代與母本性狀一致，另一種情況子代雌性與父本性狀一致，子代雄性與母本性狀一致，則該基因位于細(xì)胞核內(nèi)的x染色體上：
正交：XaXa×XAY－XAXa、XaY；
反交：XAXA×XaY－XAXa、XAy。
(2)方法二：
①實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：隱性的雌性×顯性的雄性(使用條
件：知道顯隱性關(guān)系時(shí))。
②結(jié)果預(yù)測(cè)及結(jié)論：
A 若子代中的雄性個(gè)體全為隱性性狀，雌性個(gè)體全為顯性性狀，則基因位于X染色體上：
XaXa×XAY－XAXa、XaY。
B 若子代中的雌雄個(gè)體中既有顯性性狀又有隱性性狀且各占1／2，則基因位于常染色體上：
aa× Aa－Aa、aa。
(3)方法三：
①實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：選多組顯性的雌性×顯性的雄性(使用條件：知道顯隱性關(guān)系且顯隱性基因的基因頻率相等)。
②結(jié)果預(yù)測(cè)及給論：
A 若子代中的隱性性狀只出現(xiàn)在雄性中，則基因位于X染色體上：
XAXA×XAY－XAXA、XAY；
XAXa×XAY－XAXA、XAXa、XAY、XaY。
B 若子代中的隱性性狀同時(shí)出現(xiàn)在雌性與雄性中，則基因位于常染色體上：
AA×AA－AA；
AA×Aa－AA、Aa；
Aa×Aa－AA、Aa、aa；
Aa× AA－AA、Aa。
3.2例題
(2006年全國(guó)卷I)從一個(gè)自然果蠅種群中選出一部分未過的灰色和黃色兩種體色的果蠅，這兩種體色的果蠅數(shù)量相等，兩種體色的果蠅雌、雄各半。已知灰色和黃色這對(duì)相對(duì)性狀受一對(duì)等位基因控制，所有果蠅均能正常生活，性狀的分離符合遺傳基本規(guī)律。現(xiàn)用兩個(gè)雜交組合：灰色雌蠅×黃色雄蠅、黃色雌蠅×灰色雄蠅，只做一代雜交試驗(yàn)，每個(gè)雜交組合選用多對(duì)果蠅。推測(cè)兩個(gè)雜交組合的子一代可能出現(xiàn)的性狀，并以此為依據(jù)，對(duì)哪一種體色為顯性性狀，以及控制體色的基因位于X染色體還是常染色體上這兩個(gè)問題，做出相應(yīng)的推斷(要求：只寫出子一代的性狀表現(xiàn)和相應(yīng)推斷的結(jié)論)。
解析：題目所列兩個(gè)雜交組合為正交、反交，若正交、反交子代中體色遺傳與性別無關(guān)，且黃色個(gè)體多或灰色個(gè)體多，則說明黃色或灰色為顯性，此基因位于常染色體上；若正交、反交子代中體色與性別有關(guān)，即雌性個(gè)體某體色或雄性個(gè)體某體色多，則此體色基因位于X染色體上，然后根據(jù)不同體色個(gè)體的多少來推斷哪種體色為顯性。
答案：①如果兩個(gè)雜交組合的子一代都是黃色個(gè)體多于灰色個(gè)體，并且體色的遺傳與性別無關(guān)，則黃色為顯性，基因位于常染色體上。
②如果兩個(gè)雜交組合的子一代都是灰色個(gè)體多于黃色個(gè)體，并且體色的遺傳與性別無關(guān)，則灰色為顯性，基因位于常染色體上。
③如果在雜交組合灰色雌蠅×黃色雄蠅中，子一代中的雄性全部表現(xiàn)灰色，雌性全部表現(xiàn)黃色；在雜交組合黃色雌蠅×灰色雄蠅中，子一代的黃色個(gè)體多于灰色個(gè)體，則黃色為顯性，基因位于x染色體上。
④如果在雜交組合黃色雌蠅×灰色雄蠅中，子一代中的雄性全部表現(xiàn)為黃色，雌性全部表現(xiàn)為灰色；在雜交組合灰色雌蠅×黃色雄蠅中，子一代中的灰色個(gè)體多于黃色個(gè)體，則灰色為顯性，基因位于x染色體上。
設(shè)問：拓展延伸：
1 探究基因位于XY的同源區(qū)段還是僅位于X染色體上的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
(1)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：隱性的純合雌性×顯性的純合雄性。
(2)結(jié)果預(yù)測(cè)及結(jié)論：
A 若子代中的個(gè)體全表現(xiàn)為顯性性狀，則基因位于XY的同源區(qū)段：
XaXa×XAAA－XAXa、XaYA。
B 若子代中雌性全表現(xiàn)為顯性性狀，雄性全表現(xiàn)為隱性性狀，則基因位于X染色體上：
XaXa×XAY－XAXa、XaY。
2 探究基因位于常染色體上還是位于XY染色體上的同源區(qū)段的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
(1)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：隱性的純合雌性與顯性的純合雄性雜交獲得的F1全表現(xiàn)為顯性性狀，再選子代中的雌雄個(gè)體雜交獲得F2，觀察F2表現(xiàn)型情況。
(2)結(jié)果預(yù)測(cè)及結(jié)論：
A 若F2雌雄個(gè)體中都有顯性性狀和隱性性狀出現(xiàn)，則該基因位于常染色體：
P：aaxAA－F1：Aa；
F1：Aa×Aa－F2：AA、Aa、aa。
B 若F2雄性個(gè)體中都是顯性性狀，雌雄個(gè)體中都有顯性性狀和隱性性狀出現(xiàn)，則該基因位于XY的同源區(qū)段：
P：XaXa×XAYA－XAXa、XaYA；
F1：XAXa×XaYA－XAXa、XaXa、XAYA、XaYA。
6.3.3感悟
不論基因位于常染色體上或x染色體上或Y染色體上，還是在XY染色體的同源區(qū)段，均可按如下方法解決：
①根據(jù)題意確定雜交親本組合；
②作出假設(shè)，草稿紙上書寫簡(jiǎn)要圖解，找到區(qū)別；
③如果只在雄性中出現(xiàn)，則在Y染色體上；
如果性狀的遺傳號(hào)性別無關(guān)，則在常染色體上；
如果性狀的遺傳與性別有關(guān)，則可能在X染色體上。
如果性狀的遺傳與性別有關(guān)，則可能在XY染色體同源區(qū)段。
6.4探究四：環(huán)境因素和遺傳因素對(duì)生物性狀影響的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
環(huán)境因素――外因；遺傳因素――內(nèi)因。
6.4.1例題
一種以地下莖繁殖為主的多年生野，分別生長(zhǎng)在海拔10m、500m、1000m處的同一山坡上。在相應(yīng)生長(zhǎng)發(fā)育階段，同一海拔的野菊株高無顯著差異，但不同海拔的野菊株高隨海拔的增高而顯著變矮。為檢驗(yàn)環(huán)境和遺傳因素對(duì)野菊株高的影響，請(qǐng)完成以下實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
(1)實(shí)驗(yàn)處理：春天，將海拔500m、1000m處的野菊幼苗同時(shí)移栽于10m處。
(2)實(shí)驗(yàn)對(duì)照：生長(zhǎng)于10m、500m、1000m處的野菊。
(3)收集數(shù)據(jù)：第2年秋天測(cè)量株高，記錄數(shù)據(jù)。
(4)預(yù)測(cè)支持下列假設(shè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
假設(shè)一：野菊株高的變化只受環(huán)境因素的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是：移栽至10m處野菊株高與10m處野菊株高無顯著差異。
假設(shè)
野菊株高的變化只受遺傳因素的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是：移栽至10m處野菊株高與原海拔處(500m、1000m)野菊株高無顯著差異。
假設(shè)三：野菊株高的變化受遺傳和環(huán)境因素的共同影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是：移栽至10m處野菊株高比10m處矮，比原海拔處高。
6.4.2學(xué)生感悟
要求掌握表現(xiàn)型是基因型和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。
7 教學(xué)總結(jié)
本節(jié)課主要介紹了以下四個(gè)方面的解題方法，以便應(yīng)對(duì)相關(guān)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)問題。
(1)探究一：相對(duì)性狀中顯、隱性關(guān)系確定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
(2)探究二：探究某性狀的遺傳是細(xì)胞質(zhì)遺傳還是細(xì)胞核遺傳。
(3)探究三：基因在常染色體還是x染色體上的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
(4)探究四：環(huán)境因素(外因)和遺傳因素(內(nèi)因)對(duì)生物性狀影響的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
【關(guān)鍵詞】 創(chuàng)傷弧菌； 金屬蛋白酶； 正交設(shè)計(jì)； 直觀分析； 方差分析
Abstract Objective: To optimize the expression of recombinant metalloprotease of Vvibrio vulnificus in E.coliBL21/DE3 induced by IPTG. Method: The plasmid of pET-32a-vvp/E.coliBL21 was constructed by our laboratory. Four different factors，including time， temperature， agitation speed and concentration of IPTG， were studied by orthogonal experimental design. The data were analyzed by direct calculation and ANOVA method. Results: The R value of agitation rate resulting from direct calculation was highest among four factors. The P value of agitation rate was lower than 0.05. The P value of the other factors were higher than 0.05. Conclusions: The expression level is remarkable affected by the agitation rate. The expression level of VVP protein is highest when agitation rate is 250 rpm. Therefore we have established a method for high-level expression of VVP-four hours-inducing time， 37℃-inducing temperature， 1mmol/L concentration of IPTG and agitation rate in 250rpm.
Key words vibrio vulnificus; metalloprotease; orthogonal experimental design; direct analysis; analysis of variance(ANOVA)
很多臨床病例及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，進(jìn)食被創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus，Vv）污染的食物或者皮膚破損接觸Vv均可引起Vv感染，主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的蜂窩組織炎和敗血癥［1~3］。一旦出現(xiàn)敗血癥，其死亡率高達(dá)50%以上［4~6］。因其病情兇險(xiǎn)，故對(duì)創(chuàng)傷弧菌感染的臨床早期快速診斷尤為重要。目前，Vv的致病機(jī)制尚未明了。但有研究表明該菌分泌的金屬蛋白酶（VVP）具有增加血管通透性，引起出血性損傷的作用，已被證實(shí)是創(chuàng)傷弧菌的主要毒力因素之一［7~9］，并且vvp基因在不同創(chuàng)傷弧菌菌株之間具有高度保守性。故金屬蛋白酶可作為創(chuàng)傷弧菌感染重要的臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)靶標(biāo)。而要制備以VVP為靶標(biāo)的Vv免疫檢測(cè)試劑盒，首先必須獲得作為足量高純度的VVP抗原來制備抗體。但是金屬蛋白酶作為創(chuàng)傷弧菌種特征性的外毒素，其自然分泌產(chǎn)量并不高，且由于方法學(xué)的限制，采用常規(guī)生化方法獲得足量高純度溶細(xì)胞素相當(dāng)困難。而通過基因工程的方法，我們可以在一個(gè)合適的系統(tǒng)中，使外源基因高效表達(dá)，從而生產(chǎn)有價(jià)值的蛋白質(zhì)，對(duì)其應(yīng)用或進(jìn)行功能的研究。但是外源基因在工程菌中的誘導(dǎo)表達(dá)受很多因素的影響，例如，誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度及搖菌的轉(zhuǎn)數(shù)等。因此，如何得到一種最佳的誘導(dǎo)條件組合，從而使蛋白高效穩(wěn)定的表達(dá)是我們研究的基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和質(zhì)粒
原核表達(dá)載體pET-32a-vvp由本課題組構(gòu)建；宿主菌E.coliBL21/DE3由南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院吳昆博士惠贈(zèng)。
1.1.2 誘導(dǎo)劑IPTG和篩選用氨芐青霉素
購自鼎國(guó)生物制品有限公司。
1.2 方法
1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
針對(duì)誘導(dǎo)過程中對(duì)菌體表達(dá)蛋白產(chǎn)生影響的4個(gè)因素誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度以及誘導(dǎo)時(shí)搖菌的轉(zhuǎn)數(shù)，運(yùn)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素及水平見表1。表1 因素水平表（略）
1.2.2 誘導(dǎo)
質(zhì)粒pET-32a-vvp轉(zhuǎn)化E.coliBL21/DE3后，挑取單菌落接種于含氨卞青霉素(100mg/L)的LB培養(yǎng)基中，37℃活化過夜，次日按1:100的比例轉(zhuǎn)接，37℃培養(yǎng)至OD600約0.8時(shí)即根據(jù)不同誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)條件見實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。離心收集菌體，做SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后觀察。掃描后運(yùn)用圖像分析軟件Quantity One得出各不同誘導(dǎo)條件下融合蛋白VVP的表達(dá)濃度。
1.2.3 正交試驗(yàn)直觀分析法
分別計(jì)算每個(gè)因素各水平下的平均收率，用各因素各個(gè)水平平均收率的極差R(極差=平均收率的最大值- 平均收率的最小值)來反映各因素的水平變動(dòng)時(shí)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的大小［10］。
1.2.4 方差分析
運(yùn)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)正交設(shè)計(jì)資料進(jìn)行分析。
1.2.5 結(jié)果驗(yàn)證
在由上述方法得出的最佳誘導(dǎo)條件下，對(duì)轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒pET-32a-vvp的E.coliBL21/DE3進(jìn)行誘導(dǎo)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行SDS-PAGE分析，以驗(yàn)證此組合的誘導(dǎo)條件的誘導(dǎo)表達(dá)效果。并設(shè)置轉(zhuǎn)化空載體組及未誘導(dǎo)組進(jìn)行對(duì)照。
2 結(jié)果
2.1 SDS-PAGE 結(jié)果
取16組經(jīng)不同誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)的菌液作組間平行SDS-PAGE，經(jīng)Quantity One對(duì)染色凝膠做圖像分析，來確定融合蛋白VVP表達(dá)的相對(duì)比例。SDS-PAGE 結(jié)果見圖1，圖上方的數(shù)字代表組別。經(jīng)掃描得到各組VVP的表達(dá)比例見表2。
2.2 優(yōu)化結(jié)果
2.2.1 正交試驗(yàn)直觀分析法
運(yùn)用正交試驗(yàn)直觀分析法得出的條件優(yōu)化結(jié)果見表2和圖2，K1、K2、K3、K4分別表示每個(gè)因素各水平下的蛋白表達(dá)量的均值［10］。由極值R的大小推知，各因素的重要性依次為誘導(dǎo)搖菌轉(zhuǎn)數(shù)、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑IPTG濃度。本實(shí)驗(yàn)的最佳搭配誘導(dǎo)條件為搖菌轉(zhuǎn)數(shù)250r/m、誘導(dǎo)時(shí)間4h、誘導(dǎo)溫度37℃、誘導(dǎo)劑IPTG濃度1mmol/L。表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析（略）
2.2.2 方差分析
運(yùn)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)進(jìn)行正交設(shè)計(jì)資料進(jìn)行方差分析得出的條件優(yōu)化結(jié)果見表3。搖菌轉(zhuǎn)數(shù)的P值小于0.05，即該因素對(duì)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著；而時(shí)間、溫度及IPTG濃度的P 值均大于0.05。表3 方差分析表（略）
2.2.2 結(jié)果的驗(yàn)證
在誘導(dǎo)條件為搖菌轉(zhuǎn)數(shù)250r/m、誘導(dǎo)時(shí)間4h、誘導(dǎo)溫度37℃、誘導(dǎo)劑IPTG濃度1mmol/L的情況下，VVP的表達(dá)量達(dá)到了40.67%。而其它4組對(duì)照組均無表達(dá)，見圖3。
3 討論
正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種安排多因素多水平試驗(yàn)，并利用普通的統(tǒng)計(jì)分析方法來分析試驗(yàn)結(jié)果的一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法［10］。對(duì)于多因素多水平的問題，通常都希望通過試驗(yàn)找出因素的主次關(guān)系和最優(yōu)搭配條件。用正交設(shè)計(jì)合理地安排試驗(yàn)，可以做到省時(shí)、省力、省錢，同時(shí)又能得到基本滿意的試驗(yàn)效果［10］。因此在本研究中，我們運(yùn)用這種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)融合蛋白VVP在工程菌中的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在獲得穩(wěn)定高效表達(dá)的VVP蛋白，從而為VVP的致病機(jī)理研究以及Vv免疫檢測(cè)試劑盒制備奠定基礎(chǔ)。
目的基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)培養(yǎng)方式主要有兩種，即化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)和溫度誘導(dǎo)，pET32a載體帶有啟動(dòng)子T7lac，可采用化學(xué)物質(zhì)IPTG進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)［11］。要實(shí)現(xiàn)蛋白產(chǎn)物的高表達(dá)，需要考慮重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)的最適環(huán)境條件，包括誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、搖菌的轉(zhuǎn)數(shù)及最適誘導(dǎo)劑濃度等。細(xì)菌在誘導(dǎo)后，大量能量會(huì)消耗在外源蛋白的表達(dá)上，使細(xì)菌的生長(zhǎng)提前進(jìn)入衰亡期，過度誘導(dǎo)會(huì)造成溶菌。因此需要對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行控制，找到能使外源蛋白充分表達(dá)而又不會(huì)導(dǎo)致溶菌的適當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了3個(gè)連續(xù)的時(shí)間水平1h、2h、3h。在誘導(dǎo)溫度上，不同的蛋白對(duì)溫度有不同的要求。有研究表明，有些外源蛋白在低溫下才能大量表達(dá)［12］；而本實(shí)驗(yàn)中的工程菌大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度是37℃。考慮到這兩方面的要求，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了3個(gè)溫度水平：20℃、30℃、37℃。搖菌的轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)也是極為重要的。體系溶解氧是影響菌體代謝的重要參數(shù)，外源基因在高效轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)需要大量能量，及時(shí)給予飽和需氧量對(duì)高效表達(dá)有意義［13］。加入誘導(dǎo)劑后通過改變攪拌轉(zhuǎn)數(shù)(r/min)來改變氧傳遞推動(dòng)力和液相體積氧傳遞系數(shù)，以達(dá)到調(diào)節(jié)體系溶解氧的目的。通常攪拌轉(zhuǎn)數(shù)愈大液相體積氧傳遞系數(shù)愈大，但當(dāng)r/min 很大時(shí)，體系產(chǎn)生不可避免的泡沫而阻止了氧的傳遞;同時(shí)r/min過大則產(chǎn)生較大的剪切力，亦對(duì)菌體生長(zhǎng)不利［11］。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了3個(gè)r/min水平：100、180、250。誘導(dǎo)劑IPTG的濃度對(duì)外源蛋白的表達(dá)水平有較大影響，濃度過高會(huì)對(duì)宿主菌造成損害，過低則影響誘導(dǎo)劑的效用。因此實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了4個(gè)濃度水平:0.1mmom/L、0.5mmom/L、1mmom/L、2mmom/L。
本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平不等，因此在對(duì)正交設(shè)計(jì)資料進(jìn)行直觀分析時(shí)，我們運(yùn)用平均蛋白表達(dá)量K1、K2、K3值的大小來反映各因素的不同水平對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(蛋白表達(dá)量)影響的大小，并以此確定實(shí)驗(yàn)的最佳搭配。用各因素各個(gè)水平蛋白平均表達(dá)量的極差R來反映各因素的水平變動(dòng)時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的大小。極差大的就表示該因素的水平變動(dòng)時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響大，極差小的就表示該因素的水平變動(dòng)時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響小。本實(shí)驗(yàn)中，我們得到因素的主次順序?yàn)檎T導(dǎo)搖菌轉(zhuǎn)數(shù)、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑IPTG濃度。主要因素應(yīng)取較好的水平，而次要因素，則可根據(jù)對(duì)成本、時(shí)間、收益等方面的統(tǒng)籌考慮而選取適當(dāng)?shù)乃健Ｕ辉囼?yàn)的直觀分析法簡(jiǎn)便、直觀、計(jì)算量小，但不能估計(jì)試驗(yàn)誤差，即不能區(qū)分是由于各因素的水平變化而導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的差異，還是由于試驗(yàn)的隨機(jī)波動(dòng)而導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的差異。為解決此問題，可對(duì)試驗(yàn)結(jié)果做方差分析。由表3可知，搖菌轉(zhuǎn)數(shù)的P值小于0.05，而時(shí)間、溫度及IPTG濃度的P 值均大于0.05。按方差分析法的觀點(diǎn)，只須對(duì)有顯著意義的因素確定好水平，而其它對(duì)試驗(yàn)結(jié)果沒有什么影響的因素，則可按實(shí)際需要來確定適當(dāng)?shù)乃健７讲罘治龅慕Y(jié)果與直觀分析方法得到的結(jié)果相同。并且這一結(jié)果也通過VVP的高表達(dá)(表達(dá)濃度達(dá)到了40.67％)得到了驗(yàn)證。由此得本研究的試驗(yàn)最佳組合為搖菌轉(zhuǎn)數(shù)250rpm、誘導(dǎo)時(shí)間4h、誘導(dǎo)溫度37℃、誘導(dǎo)劑IPTG濃度1mmol/L。
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10 祝國(guó)強(qiáng)，滕海英，黃平. 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法在醫(yī)藥學(xué)中的應(yīng)用.數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2007，20(4):568~569.
11 pET系統(tǒng)操作手冊(cè) Novagen.
【摘要】 目的 尋找在超聲條件下從促生長(zhǎng)散中提取水溶性成分的優(yōu)化條件并進(jìn)行含量測(cè)定。方法 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采取正交設(shè)計(jì)法，以超聲時(shí)間、提取溫度、固液比及提取次數(shù)為因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，選擇L9(34)正交表，用酸堿滴定法測(cè)定有機(jī)酸含量作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果 該提取實(shí)驗(yàn)影響因素:為提取次數(shù)>提取時(shí)間>提取溫度>固液比。結(jié)論 最佳提取條件為：超聲時(shí)間20 min，超聲溫度45 ℃，固液比1∶10，提取次數(shù)3次。
【關(guān)鍵詞】 促生長(zhǎng)散；超聲提取；正交實(shí)驗(yàn)；含量測(cè)定；有機(jī)酸
Abstract：Objective To optimize the extracting condition of water-soluble component from herbal medicine of promoted growth and determine the content of organic acid. Methods With the content of organic acid as the index， ultrasonic time， extracting temperature， ratio of solid and liquid and extracting times were screened by L9 (34) orthogonal test on the basis of single factor test. Results The effect factors of the extracting condition were as follows：extracting times>extracting time>extracting temperature>ratio of solid and liquid. Conclusion The best extracting condition was that ultrasonic time of 20 min， temperature of 45 ℃， ratio of solid and liquid of 1∶10， and extracting 3 times.
Key words：ultrasonic extraction；orthogonal experiment；content determition；organic acid
促生長(zhǎng)散是一種純中藥制劑，由山楂、甘草、地榆等中藥材組成，含有較多的水溶性成分，主要成分為有機(jī)酸[1-2]，多年來應(yīng)用效果良好。但尚存在很多不足：口感差、藥效發(fā)揮時(shí)間慢、有效成分利用率低、產(chǎn)品易發(fā)霉變質(zhì)、不易貯存、質(zhì)量可控性差等。為了提高促生長(zhǎng)散產(chǎn)品的科技含量，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品 穩(wěn)定、高效、可控的質(zhì)量要求，本研究擬采用超聲輔助技術(shù)對(duì)促生長(zhǎng)散中的水溶性成分進(jìn)行提取，為有效成分的高效利用奠定基礎(chǔ)。
1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1 主要儀器
LD隆達(dá)HF-2.5B超聲循環(huán)提取機(jī)(北京弘祥降生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，堿式滴定管(50 mL)，TDL-5臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭儀器廠)，電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)，DL-360A超聲儀(上海之信儀器有限公司)，RE52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，SHZ-CB型循環(huán)水式多用真空泵(河南鞏義市英峪寧華儀器廠)，ZK-82A型電熱真空干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司)。
1.2 藥物和試劑
促生長(zhǎng)散(石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院提供)，NaOH(A.R)、鄰苯二甲酸氫鉀(A.R)、蒸餾水、酚酞指示劑，石河子醫(yī)藥公司提供。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 含量測(cè)定
促生長(zhǎng)散中含有較多的水溶性成分，主要來源于山楂、甘草、地榆等，均含有有機(jī)酸，參照《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)山楂項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，用氫氧化鈉滴定液(0.1 mol/L)滴定，即得，每1 mL氫氧化鈉滴定液(0.1 mol/L)相當(dāng)于6.4O4 mg的枸櫞酸計(jì)算有機(jī)酸含量。
2.2 單因素試驗(yàn)
2.2.1 超聲時(shí)間
取促生長(zhǎng)散10.00 g，溶劑100 mL，在25 ℃下進(jìn)行超聲提取，每5 min取樣1次，測(cè)定滴定的NaOH的體積，并算出有機(jī)酸的含量。
2.2.2 超聲溫度
取促生長(zhǎng)散10.00 g，溶劑100 mL，在30 min提取1次的條件下，分別在25、35、45、55、65 ℃的條件下提取并測(cè)定滴定用的NaOH體積，算出有機(jī)酸的含量。
2.2.3 超聲次數(shù)
超聲次數(shù)不同提取效果不同。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超聲次數(shù)太多，浪費(fèi)溶劑，提高成本，而且給后處理帶來困難；超聲次數(shù)太少，不能充分提取出有效成分。在對(duì)大量文獻(xiàn)資料綜合分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合試驗(yàn)具體情況，選定超聲次數(shù)為1、2、3次進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。
2.2.4 固液比
固液比不同提取效果不同。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)固液比太大，影響超聲提取器的循環(huán)和攪拌；固液比太小浪費(fèi)溶劑，提高成本，而且給后處理帶來困難。在對(duì)大量文獻(xiàn)資料綜合分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合試驗(yàn)具體情況，選定固液比為1∶8、1∶10和1∶12進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。
2.3 正交試驗(yàn)
在對(duì)以上單因素分析和試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響有機(jī)酸提取效果的幾個(gè)因素，著重考察超聲時(shí)間(A)、超聲溫度(B)、固液比(C)、提取次數(shù)(D)4個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平(具體試驗(yàn)因素及水平見表1)，用L9(34)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇最佳的提取條件。表1 因素水平表（略）
3 結(jié)果
3.1 單因素實(shí)驗(yàn)
3.1.1 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響
根據(jù)超聲單因素試驗(yàn)，平行測(cè)定3次的條件下研究出提取時(shí)間對(duì)有機(jī)酸含量的影響。隨著提取時(shí)間的增加，有機(jī)酸的含量也在增加，25 min后增長(zhǎng)趨緩，因此選擇20 min左右進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。
3.1.2 超聲溫度對(duì)提取效果的影響
根據(jù)超聲單因素試驗(yàn)，平行測(cè)定3次的條件下研究出提取溫度對(duì)有機(jī)酸含量的影響。隨著提取溫度的升高，有機(jī)酸的含量也在增加，45 ℃后增長(zhǎng)趨緩，因此選擇35 ℃左右進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。
3.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
在單因素影響的基礎(chǔ)上，為探討各條件參數(shù)的相互影響，試驗(yàn)中設(shè)計(jì)了四因素三水平正交試驗(yàn)，確定應(yīng)用L9(34)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。結(jié)果見表1、表2。表2 L9(34)正交設(shè)計(jì)及結(jié)果（略）
表中因素A(時(shí)間)它的3個(gè)水平所對(duì)應(yīng)的提取百分含量以第2水平的數(shù)值為最大，所以取它的第2水平最好；因素B(溫度)以第3水平的數(shù)值為最大；因素C(固液比)以第2水平的數(shù)值為最大；因素D(提取次數(shù))以第3水平的數(shù)值為最大。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，有機(jī)酸的最佳提取條件是A2B3C2D3，即超聲時(shí)間20 min，超聲溫度45 ℃，固液比1∶10，提取次數(shù)3次。根據(jù)極差分析影響有機(jī)酸的提取因素大小為：次數(shù)>時(shí)間>溫度>固液比。該提取工藝影響因素最大的是提取次數(shù)，影響因素最小的是固液比。
3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
取促生長(zhǎng)散10.00 g，溶劑100 mL。根據(jù)篩選得到的最佳提取條件A2B1C2D3平行提取3次，分別測(cè)定有機(jī)酸的含量。結(jié)果見表3。表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）
經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，根據(jù)最佳的提取條件所測(cè)得的有機(jī)酸的含量均大于正交設(shè)計(jì)中的含量。
4 結(jié)論
促生長(zhǎng)散中水溶性成分的最佳提取條件為：超聲時(shí)間20 min，超聲溫度45 ℃，固液比1∶10，提取次數(shù)3次。促生長(zhǎng)散中水溶性成分主要來源于組方中的山楂、甘草、地榆等，所以本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)酸為評(píng)價(jià)指標(biāo)，方法簡(jiǎn)便，合理可行。
參考文獻(xiàn)
關(guān)鍵詞：二妙膠囊；鹽酸小檗堿；正交實(shí)驗(yàn)
中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-7717(2009)05-1087-02
二妙丸由蒼術(shù)、黃柏兩味藥組成，為主治濕熱流注之筋骨疼痛或兩足痿軟或足膝紅腫、下部濕瘡、帶下以及濕熱成痿諸癥的首選方劑，臨床運(yùn)用甚廣，被收錄在2005版藥典…。本次實(shí)驗(yàn)針對(duì)二妙丸服用量大，攜帶不方便的特點(diǎn)，擬將丸劑改為膠囊劑，以減小服用量，提高藥物的穩(wěn)定性和生物利用度。蒼術(shù)健脾燥濕為方中君藥。黃柏為蕓香科植物黃柏Phellodendmnam illnse Rupr(關(guān)黃柏)和黃皮樹Phellodendron ehinse Sehneid(川黃柏)的除去栓皮部分的樹皮，為中醫(yī)臨床常用的中藥材之一，具有清熱、燥濕、瀉火、解毒之功效。文獻(xiàn)報(bào)道，黃柏主要含有小檗堿、木蘭堿、黃柏堿、掌葉防己堿等多種生物堿及內(nèi)酯、甾醇、黏液質(zhì)等成分，為了更好的發(fā)揮黃柏的藥用功效，本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以鹽酸小檗堿的含量和出膏率為檢測(cè)指標(biāo)，考察溶媒濃度、溶媒用量、提取時(shí)間及提取次數(shù)等4種因素對(duì)提取工藝的影響，并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。
1 儀器與試藥
黃柏，購于四川。鹽酸小檗堿化學(xué)對(duì)照品批號(hào)：110713―200609。購自中國(guó)藥品生物制品檢定所。島津LC-10A高效液相色譜儀、浙大N3000色譜工作站、電子分析天平等。其它試劑均為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表的設(shè)計(jì)
根據(jù)初篩試驗(yàn)結(jié)果，分別確定提取溶媒(乙醇)濃度、溶媒用量、提取時(shí)間及提取次數(shù)為實(shí)驗(yàn)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，見表1。
2.2 樣品的制備
取黃柏(炒)藥材25g，共取9份，按照表1、表2分別進(jìn)行回流提取，提取液濾過，合并，回收乙醇，濃縮，定容到250mL的容量瓶中，取5mL到25mL的容量瓶中，甲醇定容，微孔濾膜過濾后，精密吸取10μL，注入高效液相色譜儀。
2.3 出膏率的測(cè)定
精密吸取濾液10mL，水浴蒸干，置于105℃烘箱中恒溫干燥3h，取出置干燥器中1h，精密稱定，計(jì)算浸膏得率。
2.4 鹽酸小檗堿的含量測(cè)定
2.4.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取鹽酸小檗堿適量，溶解制成每1mL含0.28mg的溶液。
2.4.2 實(shí)驗(yàn)條件及系統(tǒng)適用性色譜條件：色譜柱為Diamortsil C18(5μm，4.6nm×150nm)；流動(dòng)相為乙腈：0.025mL/L磷酸水溶液=1:3，檢測(cè)波長(zhǎng)265nm；柱溫40℃；流速1mL/min。理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿計(jì)算應(yīng)不低于4000。
2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
以小檗堿和出膏率為指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)為60:40。見表2、表3。
由表2、表3可以看出，影響因素D>A=C>B，且因素D具有顯著性，所以黃柏的最佳提取工藝為以D3A2C2B3。即黃柏的最佳提取工藝為10倍量的70％乙醇回流提取3次，每次1.5h。
3 討論
摘要：目的篩選芩連抗病毒膠囊醇提和水提最佳工藝。方法采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)芩連抗病毒膠囊提取工藝進(jìn)行考察，分別以組方中的黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果醇提工藝以10倍量70%的乙醇提取3次，1 h/次；水提工藝以10倍量水，煎煮2次，2 h/次所得到的黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量最高。結(jié)論此工藝對(duì)黃芩苷和鹽酸小檗堿的提取率高，穩(wěn)定性好，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
關(guān)鍵詞：黃芩苷；鹽酸小檗堿；提取工藝
Study on Extraction Processes of Qinlian Antivirus Capsule
Abstract:ObjectiveTo determine the optimum condition of extraction processes of Qinlian Antivirus Capsule.MethodsThe extraction processes were studied with the potentiametric method and the contents of baicalin and berberine hytrochloride as the markers.ResultsThe contents of baicalin and berberine hytrochloride were the highest when the following extraction condition was used:extracting with 70% alcohol and 10 times solvent for an hour a time and the process was repeated three times，and the extraction process of water is that 10 times solvent ，boiling twice ，2 hours per-time.ConclusionThe contents of baicalin and berberine hytrochloride are high and the stability is good when this extraction process is used. This extraction process is suitable for industrial production.
Key words:Baicalin; Berberine hytrochloride; Extraction process
芩連抗病毒膠囊由黃芩、黃連、桔梗、牛蒡子等組成。具有清瘟解毒之功效，用于外感時(shí)疫或外感風(fēng)熱引起的頭疼身痛，惡寒發(fā)熱，喉痛咳嗽，痄腮紅腫等諸癥。黃芩苷和鹽酸小檗堿分別是方中君藥和臣藥的主要有效成分［1～3］，故本實(shí)驗(yàn)以黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量為指標(biāo)采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)醇提工藝和水提工藝進(jìn)行考察，以確定芩連抗病毒膠囊的最佳提取工藝。
1 儀器與試藥
高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫1100)；Extend ODS C18色譜柱 (大連依利特)；微量進(jìn)樣器（HAMITON COMPANY）；島津CS9301雙波長(zhǎng)薄層掃描儀；KQ3200DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；定量毛細(xì)管（美國(guó)Drummond Co.）。液相用試劑均為色譜純；薄層用試劑均為分析純。試驗(yàn)用藥材購自鄭州市神州大藥房，經(jīng)鑒定，符合《中國(guó)藥典》規(guī)定。
2 醇提工藝考察及結(jié)果
2.1色譜條件［4］用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇水磷酸（47∶53∶0.2）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫室溫。
2.2 對(duì)照品溶液的制備取黃芩苷對(duì)照品加甲醇制成每毫升含60 μg的溶液作為對(duì)照品溶液。
2.3 線性化范圍考察精密稱取減壓干燥后的黃芩苷對(duì)照品，用甲醇溶解制成每毫升含黃芩苷149.3 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密吸取黃芩苷對(duì)照品溶液2，4，6，8，10 μl注入液相色譜儀，按以上條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表1。表1 黃芩苷線性化范圍實(shí)驗(yàn)（略）
其回歸方程為y=122.85+3.077 7x，r=0.999 6黃芩苷在0.298 6～1.493 μg之間呈一通過原點(diǎn)的直線。
2.4 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μl，注入液相色譜儀，按上條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表2。表2 精密度實(shí)驗(yàn)（略）
結(jié)果表明：黃芩苷精密度良好，符合定量分析要求。
2.5 據(jù)資料表明［5］處方中黃芩，桔梗，牛蒡子，甘草四味藥物中的主要成分均為苷類化合物，且為其活性成分。因?yàn)檐疹惢衔镌诤嫉娜芙庑暂^好，為了有效提取此類化合物，以保證藥效，同時(shí)也為了減少藥物服用量，故對(duì)以上幾味藥物采用不同濃度的乙醇來提取。
2.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果考慮加醇量、乙醇濃度、提取時(shí)間及提取次數(shù)，其因素水平表見表3。表3 黃芩、桔梗、牛蒡子、甘草乙醇提取因素水平（略）
2.7 黃芩苷含量測(cè)定取乙醇提取液適量作為供試品溶液；參照《中國(guó)藥典》2000年版Ⅰ部黃芩藥材含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇水磷酸（47∶53∶0.2）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，照高效液相色譜法［4］測(cè)定，分別精密吸取對(duì)照品溶液10 μl和供試品溶液5 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。結(jié)果見表4，方差分析見表5。表4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果實(shí)驗(yàn)（略）表5 方差分析方差來源 （略）
2.8 樣品測(cè)定精密稱定3批一定量藥樣，照優(yōu)化條件提取：加70%的乙醇10倍量提取3次，1 h/次，提取液作為供試品溶液按照2.7項(xiàng)下黃芩苷的含量測(cè)定方法測(cè)定，得黃芩苷相當(dāng)于藥材含量分別為10.522％，10.308％，10.617％，RSD=1.51％。
3 水提工藝考察及結(jié)果
3.1 工藝條件篩選據(jù)研究資料表明，處方中黃連主要含生物堿類化合物，以小檗堿含量最高，同時(shí)小檗堿也為其主要有效成分，小檗堿在熱水中溶解度較好；方中石膏為礦物藥，其主要成分為CaSO4?10H2O，根據(jù)傳統(tǒng)中藥理論，石膏以久煎入藥，故把黃連，石膏采用水煎煮的方法提取，在煎煮過程中，采用正交實(shí)驗(yàn)法來篩選最佳工藝，其影響因素主要有：加水量、煎煮次數(shù)、煎煮時(shí)間等，因素水平見表6。表6 黃連、石膏共水煎煮因素水平（略）
3.2 鹽酸小檗堿含量測(cè)定［4］精密量取各正交組取提取液適量，加鹽酸甲醇（1∶100）稀釋作為供試品溶液；另取鹽酸小檗堿對(duì)照品加甲醇制成1 ml含0.5 mg的溶液作為對(duì)照品溶液；參照《中國(guó)藥典》2000年版Ⅰ部黃連藥材含量測(cè)定項(xiàng)下測(cè)定方法，分別吸取供試品溶液6 μl，對(duì)照品溶液2 μl和4 μl，交叉點(diǎn)于同一硅膠G板上，以苯醋酸乙酯異丙醇甲醇水（6∶3∶1.5∶1.5∶0.3）為展開劑，另槽加入等體積濃氨試液，預(yù)平衡15 min，展開，取出，揮干，照薄層色譜法進(jìn)行熒光掃描，激發(fā)波長(zhǎng)λ=348 nm，測(cè)定供試品與對(duì)照品熒光強(qiáng)度的積分值，計(jì)算，即得。測(cè)定結(jié)果見表7，方差分析見表8。表7 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果實(shí)驗(yàn)（略） 表8 方差分析方差來源 （略）
3.3 基于上述正交實(shí)驗(yàn)各影響因素沒有顯著性差異由直觀分析可知煎煮時(shí)間和加水量影響因素較大，故擬以煎煮時(shí)間和加水量做兩因素兩水平正交實(shí)驗(yàn)，考察指標(biāo)為小檗堿百分含量。因素水平見表9，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表10。表9 因素水平水平（略）表10 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)（略）
3.4 樣品測(cè)定精密稱取3批一定量藥樣，照優(yōu)化條件提取：加10倍量水，煎煮2次，2 h/次；提取液按照3.2項(xiàng)下鹽酸小檗堿含量測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定，分別得鹽酸小檗堿相當(dāng)于藥材含量為5.464%，5.378%，5.527%，RSD=1.37％。
4 結(jié)果分析及討論
4.1 表5方差分析表明，因素A，B，C，D對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響都非常顯著。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取顯著因素的最好水平，得到醇提最佳工藝條件為，A2B3C2D3，即以10倍量70%的乙醇提取3次，1 h/次。3批驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定可行。
4.2 表8方差分析表明，因素A、B、C均不具有顯著性，但由直觀分析可知，煎煮時(shí)間和加水量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大影響，煎煮次數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小，故以煎煮時(shí)間和加水量做兩因素兩水平正交實(shí)驗(yàn)對(duì)水提工藝?yán)^續(xù)進(jìn)行考察，考察指標(biāo)為小檗堿百分含量。由表10結(jié)果直觀分析表明，因素A對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較因素B大，結(jié)合兩次的正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定最佳水提工藝為：10倍量水，煎煮2次，2 h/次。3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定可行。
參考文獻(xiàn)
［1］賀海平，梁寧生.002黃芩藥理研究的新進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)?中醫(yī)中藥分冊(cè)，2000，22（1）：14.
［2］瞿佐發(fā).黃芩的藥理作用及臨床應(yīng)用［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2002，13（5）：316.
［3］耿東升，劉發(fā).小檗堿藥理作用研究進(jìn)展［J］.人民軍醫(yī)藥學(xué)專刊，1997，13（1）：24.
【摘要】
目的對(duì)從老鷹茶中提取總皂苷的工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法以齊墩果酸為對(duì)照品，香草醛-高氯酸法顯色，用紫外分光光度法在550 nm處測(cè)定總皂苷含量。采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，以老鷹茶總皂苷含量為考察指標(biāo)，考察乙醇濃度、提取時(shí)間、乙醇用量、提取次數(shù)4個(gè)因素對(duì)提取的影響。結(jié)果最佳提取工藝為80 %乙醇，12倍量，回流提取3次，1 h/次。結(jié)論該工藝經(jīng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，對(duì)進(jìn)一步的工藝開發(fā)有較好的參考價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】 老鷹茶 總皂苷 正交實(shí)驗(yàn) 紫外分光光度法
老鷹茶系樟科木姜子屬毛豺皮樟Litsea coreana Leve的葉，俗稱“白茶”，分布于云南、貴州、四川、安徽等地。民間飲用表明老鷹茶具有解毒消腫、明目益思、生津止渴、解表防暑等功效，且無毒副作用，為藥食同源植物［1］，長(zhǎng)期飲用有益于健康。老鷹茶中含有黃酮、皂苷、有機(jī)酸、香豆素和鞣質(zhì)等成分，其中皂苷類成分含量豐富［2］。研究老鷹茶的化學(xué)成分，對(duì)研究天然產(chǎn)物化學(xué)多樣性，以及尋找新的藥用成分具有重要意義。為了有效開發(fā)和利用資源，本文采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)老鷹茶總皂苷的提取工藝進(jìn)行了研究。
1 儀器與試藥
1.1 儀器722S分光光度計(jì)；8453紫外-可見分光光度計(jì)(Agilent)；電子天平BP211D (Sartorius)；GSY-8電熱恒溫水浴鍋；EK-S5AB電熱真空干燥箱。
1.2 試藥齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國(guó)藥品生物制品檢定所；老鷹茶，2006-05購自安徽省寧國(guó)縣茶農(nóng)，陰干備用，經(jīng)植物學(xué)鑒定為樟科木姜子屬毛豺皮樟Litsea coreana Leve的葉。試劑均為分析純，水為雙蒸餾水。
2 方法與結(jié)果
2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作［3］精密稱取經(jīng)120℃干燥至恒重的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，置于25 ml容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液(每毫升含齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品0.2 mg)。精密量取對(duì)照品溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml于10 ml試管中，抽干甲醇，加0.2 ml 5%香草醛，0.8 ml高氯酸，搖勻于60℃水浴中加熱15 min，冷卻，加冰醋酸5 ml，搖勻。以相應(yīng)試劑做空白，在8453紫外-可見分光光度計(jì)上進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，最大吸收波長(zhǎng)為（λmax）550 nm。按分光光度法在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度值(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)繪圖，得回歸線性方程Y = 53.666X-0.067 4，r=0.999 9，線性范圍：6.666 7～33.333 3 mg ·L-1。
2.2 提取溶劑的選擇
2.2.1 水提取法精密稱取老鷹茶5 g，加水50 ml，在水浴上加熱回流提取1 h，趁熱過濾，共提取2次，洗滌殘?jiān)喜V液和洗滌液，蒸干溶劑。固體水溶后，正丁醇萃取，萃取液過氧化鋁柱，收集流出液，定容至200 ml容量瓶中，搖勻，待用。
2.2.2 乙醇提取法精密稱取老鷹茶5 g，加80 %乙醇50 ml，在水浴上加熱回流提取1 h，趁熱過濾，共提取2次，洗滌殘?jiān)喜V液和洗滌液，蒸干溶劑。固體水溶后，正丁醇萃取，萃取液過氧化鋁柱，收集流出液，定容至200 ml容量瓶中，搖勻，待用。
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2.2.3 樣品中總皂苷的含量測(cè)定精密量取供試品溶液0.3 ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進(jìn)行操作，測(cè)定吸光度值，由回歸方程計(jì)算樣品中總皂苷的含量。結(jié)果見表1。
表1 提取溶劑與含量的關(guān)系（略）
2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果根據(jù)藥材性質(zhì)和生產(chǎn)實(shí)際要求，擬定影響浸出效果的4個(gè)主要因素，即A為乙醇濃度(%)，B為乙醇用量(倍體積)，C為提取時(shí)間(h/次），D為提取次數(shù)，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，編制因素水平表見表2。
表2 因素水平（略）
稱取適量老鷹茶干燥粗粉9份，按正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的工藝進(jìn)行提取，以老鷹茶提取物中總皂苷含量為考核指標(biāo)，對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析見表3～4。
表3 正交試驗(yàn)(L934)直觀分析（略）
表4 方差分析（略）
根據(jù)分析結(jié)果可知，各個(gè)因素對(duì)老鷹茶總皂苷提取效果的影響程度依次為A（乙醇濃度）>D（提取次數(shù)）>C（提取時(shí)間）>B（乙醇用量），且對(duì)提取效果影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素是因素A（乙醇濃度）。綜合直觀分析和方差分析的結(jié)果，老鷹茶總皂苷理想的提取工藝方案是A3B3C1D3，即用12倍量的80% 乙醇，回流提取3次，1 h/次。
2.4 提取工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步考察上述最佳工藝的穩(wěn)定性和合理性，按該工藝條件進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)3次，分別測(cè)定老鷹茶總皂苷的含量。結(jié)果見表5。測(cè)定的結(jié)果均等于或優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)表中的任何一組，重復(fù)性好，RSD = 0.934% (n=3)。說明該工藝穩(wěn)定可行。
表5 最佳工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（略）
3 討論
香草醛-高氯酸法顯色體系最大吸收波長(zhǎng)在550 nm處，該顯色體系呈色穩(wěn)定，但由于老鷹茶粗提物中有色物質(zhì)的干擾，粗提物須經(jīng)過氧化鋁脫色。樣品脫色后顯色在近550 nm處有最大吸收，因此該顯色體系可用于老鷹茶總皂苷含量測(cè)定。
由正交實(shí)驗(yàn)的直觀分析和方差分析結(jié)果可知，從總皂苷這一指標(biāo)來看，因素A（乙醇濃度）的影響最大，差異性最為顯著；老鷹茶總皂苷的最佳提取工藝為12倍量的80%乙醇，回流提取3次，1 h/次。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的工藝簡(jiǎn)單，操作容易，穩(wěn)定性好。
參考文獻(xiàn)
［1］ 李延松. 老鷹茶資源調(diào)查與開發(fā)利用［J］.貴州茶葉，1995，4:10.
【關(guān)鍵詞】 芒果止咳片；，，薄膜包衣；，，正交實(shí)驗(yàn)
摘要：目的通過優(yōu)化選擇薄膜包衣的生產(chǎn)工藝條件，提高芒果止咳包衣片的穩(wěn)定性。方法通過正交實(shí)驗(yàn)摸索薄膜包衣工藝的最佳條件，并通過溶出度、耐溫耐濕實(shí)驗(yàn)，比較糖衣及薄膜衣對(duì)芒果止咳片理化性質(zhì)的影響。結(jié)果薄膜包衣可提高芒果止咳片的儲(chǔ)存期穩(wěn)定性。結(jié)論 芒果止咳片采用薄膜包衣比糖衣有優(yōu)勢(shì)。
關(guān)鍵詞：芒果止咳片； 薄膜包衣； 正交實(shí)驗(yàn)
Abstract：ObjectiveTo optimize the thin film coating production craft. MethodsBy orthogonal experiment， we tried to find out the optimum condition to thin film coating production craft and compared the different effects on Mango Anticough Tablet's physics and chemistry nature applying sugarcoating and thin film coating separately by dissolution， heat and humidity test. ResultsThin film coating can promote the storage stability of Mango Anticough Tablet. ConclusionApplying thin film coating has more advantages to Mango Anticough Tablet.
Key words：Mango anticough tablet； Thin film coating； Orthogonal experiment
芒果止咳片是由芒果葉提取物、魚腥草素鈉等制成的中藥片劑，目前的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)指定包糖衣［1］。糖衣片吸濕性強(qiáng)，且易裂片、出現(xiàn)色斑，降低了產(chǎn)品質(zhì)量。我們采用薄膜包衣技術(shù)對(duì)芒果止咳片進(jìn)行包衣，有效解決了上述問題。
1 儀器與試藥
BGB150C型包衣機(jī)（溫州市制藥設(shè)備廠）；TM85型膠體磨（天津市鑫普機(jī)械制造有限公司）；HG53型快速鹵素水分測(cè)定儀（瑞士梅特勒）；SPX250C型恒溫恒濕箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；1014型電烤箱（上海醫(yī)療機(jī)械廠）；RC6型溶出度測(cè)試儀（天津光學(xué)儀器廠）。芒果止咳片片芯（廣西中醫(yī)學(xué)院制藥廠，批號(hào)20050419）；聚丙烯酸樹脂Ⅳ號(hào)（江蘇省蘇州市立新醫(yī)藥原料有限公司，批號(hào)20041026）；HPMC（濰南山沙藥用輔料有限公司，批號(hào)20040804）；吐溫80（汕頭市西隴化工廠，批號(hào)20040708）；95%乙醇（工業(yè)級(jí)，廣西南寧化工廠，批號(hào)200411082）。
2 方法與結(jié)果
2.1 糖衣片的制備先預(yù)熱包衣鍋（30～40℃），將合格的片芯置于包衣鍋內(nèi)，啟動(dòng)包衣鍋使片芯均勻受熱，分別上隔離層，粉衣層，糖衣層，色衣層，打光。
2.2 薄膜衣片的工藝及其優(yōu)化
2.2.1 包衣液配制 取聚丙烯酸樹脂Ⅳ號(hào)90 g與HPMC20 g分別溶于適量95 %和70 %乙醇中，靜置浸泡過夜，待完全溶解，分別加95 %和70 %乙醇至總體積1 000 ml，將兩者混勻，依次加入吐溫80、蓖麻油、滑石粉、鈦白粉適量，過膠體磨反復(fù)研磨均勻，過120目篩備用。
2.2.2 包衣先預(yù)熱包衣鍋（30～40℃），將合格的片芯置于包衣鍋內(nèi)，啟動(dòng)包衣鍋使片芯均勻受熱，將配制好的包衣液用噴槍噴霧于轉(zhuǎn)動(dòng)的片芯表面，以60～70℃熱風(fēng)干燥，連續(xù)噴霧至片面完整光潔，色澤均勻，停止噴霧。用熱風(fēng)繼續(xù)干燥10 min后，再用冷風(fēng)吹干即得。
2.2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：影響薄膜包衣質(zhì)量的因素主要有片芯的硬度、包衣液濃度、噴霧流量等，將之作為考察因素，并相應(yīng)安排了3個(gè)水平，選L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)。見表1。
表1 因素及水平（略）
指標(biāo)確定：以薄膜衣片芒果膏主要有效成分芒果苷溶出度及薄膜衣片外觀合格率為指標(biāo)，實(shí)施綜合評(píng)分。溶出度實(shí)驗(yàn)：按《中國(guó)藥典》第1法［2］設(shè)定轉(zhuǎn)籃轉(zhuǎn)速為120 r/min，溶出介質(zhì)為人工胃液，進(jìn)行溶出度實(shí)驗(yàn)，在45 min取樣5 ml，微孔濾膜過濾，濾液按文獻(xiàn)［3］測(cè)定芒果苷，與樣品薄膜衣片芒果苷含量比較，計(jì)算薄膜衣片芒果苷在45 min溶出度。溶出量％最高者記“10”分，最低者記“0”，按公式Xj=(Y10-Y0)×(Y10-Yj)/10依次類推；外觀合格率實(shí)驗(yàn)：每批取100片，按文獻(xiàn)［2］薄膜衣片外觀標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判合格率，合格率％“< 80”，記“0”分，“≥80，85，90，95，98”依次記“2，4，6，8，10”分。因溶出度是評(píng)價(jià)中藥片劑溶出特性的關(guān)鍵指標(biāo)，溶出度作為重要指標(biāo)，參照文獻(xiàn)［4］系數(shù)設(shè)為1.5，外觀合格率系數(shù)設(shè)為1，綜合評(píng)分值＝1.5X1＋X2。結(jié)果見表2。
表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果（略）
正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：方差分析見表3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，片芯硬度、包衣液濃度和噴霧流量對(duì)薄膜包衣有顯著性影響，其中片芯硬度對(duì)薄膜包衣影響最大，其次是包衣液濃度和噴霧流量根據(jù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取芒果止咳薄膜包衣工藝為A2B1C2。按此條件試生產(chǎn)的芒果止咳片，達(dá)到預(yù)期的效果。
2.3 質(zhì)量分析
2.3.1 溶出度按正交實(shí)驗(yàn)樣品溶出度實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定。結(jié)果見表4。
表4 溶出度實(shí)驗(yàn)（略）
2.3.2 耐低溫、高溫實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)研究了薄膜衣片（開放式）與糖衣片（開放式）分別在低溫，高溫條件下對(duì)外觀的影響。結(jié)果見表5。
表5 耐溫實(shí)驗(yàn)（略）
2.3.3 抗?jié)駥?shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)研究薄膜衣片及糖衣片暴露在高溫(40℃)、高濕(75%)環(huán)境下存放30 d，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果見表6。
表6 抗?jié)駥?shí)驗(yàn)（略）
3 討論
3.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：片芯硬度4~5 kg?mm-2，包衣液濃度8%，噴霧流量0.30~0.34 kg?min1.為芒果止咳片芯的薄膜包衣工藝最佳條件，按此工藝條件進(jìn)行生產(chǎn)驗(yàn)證，芒果止咳薄膜衣片符合藥典薄膜衣片標(biāo)準(zhǔn)，主要成分芒果苷溶出量為88.5％，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，提示芒果止咳片芯的薄膜包衣工藝是可行的。
3.2 對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芒果止咳薄膜衣片中芒果苷溶出量明顯高于糖衣片，在低溫、高溫、高濕環(huán)境，薄膜衣片外觀、硬度、崩解時(shí)限、水分各項(xiàng)指標(biāo)基本穩(wěn)定，而糖衣片已嚴(yán)重吸潮變質(zhì)，提示芒果止咳薄膜衣片溶出特性、抗?jié)瘛⒛蜏匦阅苊黠@優(yōu)于糖衣片。
3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芒果止咳薄膜包衣片的抗?jié)瘛⒛蜏亍⒖寡醯确€(wěn)定性都有較大提高，并且有較好的溶出特性，提示了中藥浸膏片采用薄膜包衣有優(yōu)勢(shì)，中藥浸膏薄膜包衣片在貯運(yùn)過程中具有較好的抗磨損、抗吸潮變質(zhì)性能，穩(wěn)定了產(chǎn)品質(zhì)量。
參考文獻(xiàn)
［1］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)?中藥成方制劑，第5冊(cè)［S］.1992：50.
［2］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典，Ⅰ部［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：附錄7，附錄75.
【摘要】
目的篩選咳安含片的最佳提取工藝。方法采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取的條件進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果最佳提取工藝為用70%的乙醇滲漉，滲漉速度為2 ml/min，浸泡時(shí)間5 d，川貝母粉碎成粗粉提取效果最佳。結(jié)論該工藝所制成品含量穩(wěn)定。
【關(guān)鍵詞】 咳安含片 正交實(shí)驗(yàn) 西貝堿 制備工藝
Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction technology of KeAn buccal tablets.MethodsAn orthogonal experimental design was adopted to optimize the technology for the extraction of the percolate .ResultsThe optimum conditions for the extraction technology were found to be: the concentration of ethanol was70%， the time for immersion of the drug was 5 days， 8 volumes of ethanol were used for the extraction of volume of the drug and the flow rate was 2 ml·min-1.ConclusionThe preparation with this technology is of high clarity and stable contents.
Key words：KeAn Buccal Tablet; Orthogonal test; Imperialine; Preparation technology
咳安含片是由川貝母、枇杷葉、桔梗、薄荷腦組成的方劑，其功能為清熱宣肺、化痰止咳，主要用于感冒咳嗽及支氣管炎。其制備工藝受多種因素影響，導(dǎo)致含片質(zhì)量不穩(wěn)定。為了更好地控制其質(zhì)量，為制備工藝提供科學(xué)性依據(jù)，本文根據(jù)處方中川貝母的主要成分西貝堿含量為指標(biāo)［1］，采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)其提取工藝進(jìn)行了系統(tǒng)考察，以篩選出最佳提取工藝。
1 儀器與試藥
薄層掃描儀(TCL 瑞士CAMAG)；點(diǎn)樣儀(瑞士)，Compa計(jì)算機(jī)(配CATS軟件)， PBQ-I 型薄層自動(dòng)鋪板器(重慶南岸新力實(shí)驗(yàn)電器廠)；定量毛細(xì)管(美國(guó))；250超聲波清洗器(上海超聲波儀器廠) 硅膠(青島海洋化工廠)；西貝堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），咳安含片（河南大學(xué)藥物研究所）。
2 方法與結(jié)果
2.1 工藝正交實(shí)驗(yàn)選擇乙醇濃度、滲漉速度、浸泡時(shí)間、藥材粒度、乙醇用量5種因素進(jìn)行考察，選用L8（2）7表安排實(shí)驗(yàn)，考查指標(biāo)為西貝堿含量。因素水平見表1。
表1 因素水平（略）
2.2 咳安含片的制備按L8（2）7正交表設(shè)計(jì)的工藝條件，以處方比例稱取各藥材， 系取川貝母粉碎成粗粉，照流浸膏劑與浸膏劑項(xiàng)下的方法（附錄IO），用乙醇作溶劑，浸漬后，緩緩滲漉，收集初漉液，另器保存，繼續(xù)滲漉，俟可溶性成分完全漉出，續(xù)漉液濃縮至適量，加入初漉液，混合，繼續(xù)濃縮成相對(duì)密度1.30~1.32（60~65℃測(cè)）的浸膏，減壓干燥備用；將桔梗和枇杷葉加水煎煮兩次，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對(duì)密度1.30~1.32（60~65℃測(cè)）的浸膏，減壓干燥，與川貝母提取物粉碎成細(xì)粉，加甜蜜素、蔗糖等輔料。混勻，用50%乙醇制粒，干燥，整粒，加薄荷腦0.85 g，杏仁香精適量、硬脂酸鎂混勻，壓成1 000片。
2.3 含量測(cè)定
2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密吸取西貝堿對(duì)照溶液1，2，3，4，5 μl（每個(gè)量點(diǎn)兩個(gè)點(diǎn)），分別點(diǎn)于同一硅膠G-CMC薄層板上，依法展開，顯色，掃描測(cè)定，以點(diǎn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，面積積分值為縱坐標(biāo)，回歸方程為Y=527.07X+47.27，r=0.999 8。結(jié)果表明，點(diǎn)樣量0.26~1.60 μg內(nèi)，點(diǎn)樣量與面積積分值呈良好線性關(guān)系。因直線不通過0點(diǎn)，所以用外標(biāo)二點(diǎn)法。
2.3.2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取已測(cè)得西貝堿含量的同一批樣品5份，分別精密加入一定量西貝堿對(duì)照品，依法測(cè)定，計(jì)算西貝堿的平均回收率為95.60%，RSD為1.60%。
2.3.3 樣品含量測(cè)定
供試品溶液的制備：取本品 60 g ，精密稱定，研成細(xì)粉。取細(xì)粉30 g，精密稱定，加氨水4 ml，精密加氯仿100 ml稱定重量，超聲處理30 min，放至室溫，用氯仿補(bǔ)足重量，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液50 ml，水浴蒸干，殘?jiān)勇确逻m量使溶解定容1 ml容量瓶中，作為供試品溶液。
對(duì)照品溶液的制備：精密稱定西貝堿對(duì)照品一定量，加氯仿制成0.26m g/ml溶液，即得。
含量測(cè)定：精密吸取對(duì)照品溶液2 μl（點(diǎn)2個(gè)點(diǎn)）與5 μl（點(diǎn)2個(gè)點(diǎn)），供試品溶液10 μl（點(diǎn)2個(gè)點(diǎn)），分別交叉點(diǎn)于同一硅膠G-CMC薄層板上，同法展開，顯色、掃描、測(cè)定并計(jì)算西貝堿的含量。結(jié)果見表2。
表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及西貝堿的含量（略）
2.4 結(jié)果分析用正交實(shí)驗(yàn)的直觀分析法進(jìn)行分析，從R的大小可知：因素的主次順序?yàn)锳＞B＞C＞D＞E。因素E的極差小于第3空列的極差。所以可以認(rèn)為因素E的極差是由實(shí)驗(yàn)誤差造成的。為減少乙醇的用量，節(jié)約成本，E取E2，因ⅠA＞ⅡA ，ⅠB＞ⅡB ，ⅠC＞ⅡC，ⅠD＞ⅡD，所以A用A1， B用B1，C用C1，D用D1，即用70%的乙醇滲漉，滲漉速度為2 ml/min， 浸泡時(shí)間5 d，川貝母粉碎成粗粉提取效果最佳。
3 討論
本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)法，以西貝堿含量為指標(biāo)，對(duì)咳安含片的提取進(jìn)行了優(yōu)選，選出了最佳工藝，并進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以優(yōu)選工藝所制產(chǎn)品含量較穩(wěn)定。川貝母生藥中含有生物堿類物質(zhì)，因此以測(cè)定西貝堿含量來控制本制劑質(zhì)量，此方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、準(zhǔn)確， 回收率為95.60%，RSD為1.60%， 可作為工藝研究和制劑質(zhì)量控制依據(jù)。
【摘要】
目的優(yōu)選超臨界CO2萃取薤白揮發(fā)油成分的工藝條件。方法通過正交實(shí)驗(yàn)，以萃取的壓力、溫度、時(shí)間為主要因素，考察薤白揮發(fā)油的最佳提取工藝。結(jié)果最佳工藝為壓力15 MPa，溫度30 ℃，時(shí)間3 h，其揮發(fā)油得率為1.093 %，是水蒸氣蒸餾法得率（0.296 %）的3.7倍。結(jié)論超臨界萃取具有耗時(shí)少、效率高等優(yōu)點(diǎn)，適合批量生產(chǎn)。
【關(guān)鍵詞】 薤白； 揮發(fā)油； 超臨界萃取； 正交實(shí)驗(yàn)
Abstract：ObjectiveTo choose the optimal extraction conditions from the volatile oils of Bulbus Allii Macrostemonis by supercritical carbon dioxide.MethodsThe orthogonal experiments were used to choose the optimal conditions，and the factors were pressure，temperature，time and the yield of extraction.ResultsThe optimal conditions:pressure 15 MPa，temperature 30℃ and time 3 hours.Under the above optimal conditions，the yield of the volatile oils was 1.093%，which was 3.7 times of the yield(0.296%) of stream distillation.ConclusionThe extraction by supercritical carbon dioxide has advantages such as high effect，short time etc.and it can be used in factory.
Key words：Bulbus Allii Macrostemonis; Volatile oils; Extraction by SFE-CO2; Orthogonal experiments
薤白為百合科蔥屬植物小根蒜Allium macrostemon Bunge或薤Allium chinese G．Don的干燥鱗莖，為常用的藥食兩用植物，主產(chǎn)于黑龍江、吉林、遼寧、河北、山東、湖北、四川、云南等地。其味苦、辛，性溫，無毒，有溫中通陽、理氣寬胸、還陽散結(jié)之功效［1］。臨床常用于胸悶刺痛、心痛徹背、瀉痢后重、肺氣喘急等疾病。薤白揮發(fā)油中主要為含硫化合物、含氮化合物、甾體皂苷等成分，能強(qiáng)烈抑制血小板聚集、防止動(dòng)脈粥樣硬化等，還具有抗癌活性［2］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，瓜蔞薤白湯治療冠心病、心絞痛總有效率達(dá)95.19 %；薤白膠丸治療原發(fā)性高脂血癥，能使血脂及過氧化脂質(zhì)顯著降低；應(yīng)用薤白單味藥對(duì)支氣管哮喘的即時(shí)止喘療效為57 %～78 ％。本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)法，以揮發(fā)油提取率為指標(biāo)，優(yōu)選冠脈通膠囊配方中主要成分之一的薤白的超臨界CO2萃取工藝，為薤白揮發(fā)油的生產(chǎn)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1
儀器與試藥
5＋1升超臨界CO2萃取裝置(四川德陽四創(chuàng)科技有限公司)；水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油裝置；FE130型藥物粉碎機(jī)。所用試劑均為分析純；CO2為食品級(jí)（峨眉山涌鑫氣體公司提供）；薤白藥材購自成都五塊石藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地為云南，經(jīng)本院宋良科副教授鑒定為百合科蔥屬植物小根蒜的干燥鱗莖，將薤白樣品粉碎成粉末狀，過40目篩，待用。
2
方法
2.1
水蒸氣蒸餾提取稱取薤白樣品粉末250 g，置入2 000 ml圓底燒瓶中，加入1 200 ml超純水，浸泡過夜，加熱至微沸，保持此條件回流8 h，所得揮發(fā)油用乙醚收集，揮干乙醚后，稱取揮發(fā)油質(zhì)量，計(jì)算得率，并于具塞棕色玻璃瓶中密閉保存，待用。
2.2
超臨界CO2萃取
2.2.1
正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)預(yù)試結(jié)果，確定以揮發(fā)油提取率為指標(biāo)，選擇萃取壓力(因素A)、溫度(因素B)和時(shí)間(因素C)作為考察因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，因素水平表見表1。
表1 超臨界萃取正交實(shí)驗(yàn)因素水平（略）
2.2.2 萃取方法取薤白樣品粉末750 g，投入5 L萃取釜中，按表1中設(shè)定的工藝參數(shù)萃取，分離釜壓力為5.5～6.0 MPa，溫度與萃取釜相同，調(diào)節(jié)CO2流量為25.00 L/h，待萃取釜壓力達(dá)到設(shè)定壓力后，先靜態(tài)萃取30 min，再動(dòng)態(tài)萃取至設(shè)定時(shí)間。
3
結(jié)果
3.1
水蒸氣蒸餾提取結(jié)果共做了3組薤百揮發(fā)油的水蒸氣蒸餾實(shí)驗(yàn)，揮發(fā)油的收率分別為0.291 %，0.294 %和0.303 %，平均收率為0.296 %。
3.2
超臨界萃取結(jié)果萃取結(jié)果見表2～3。可見，超臨界萃取薤白揮發(fā)油的影響因素中，溫度影響較其它兩項(xiàng)顯著，萃取時(shí)間的影響次之，萃取壓力的影響最不顯著。由此得出超臨界萃取薤白揮發(fā)油的最佳工藝條件為A1B1C2，即萃取壓力15 MPa，萃取溫度30 ℃，萃取時(shí)間3 h。
表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）
表3 方差分析（略）
3.3
驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按最佳工藝條件為A1B1C2，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，揮發(fā)油得率平均值為1.093 ％，表明實(shí)驗(yàn)所確定的最佳工藝條件比較符合實(shí)際。
4
討論
通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選出了CO2超臨界萃取薤白揮發(fā)油的最佳工藝，與傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法提取薤白揮發(fā)油相比較，后者工藝簡(jiǎn)單、成本低，但提取率相對(duì)也較低；前者雖提取率較高，因系統(tǒng)需高壓操作，對(duì)儀器設(shè)備要求較高，故提取成本高，但由于其工藝條件溫和(無高溫及溶劑無毒)，溶劑回收處理非常簡(jiǎn)單、無殘留（在萃取過程中的分離釜中完全分離，分離出的CO2還可以循環(huán)使用），萃取后的藥材殘?jiān)誀罨緹o變化，對(duì)藥材中其他成分破壞較少，可根據(jù)需要進(jìn)一步處理。相對(duì)而言，超臨界萃取提取工藝具有更大的優(yōu)勢(shì)，可為含薤白藥材制劑的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。
【參考文獻(xiàn)】
【摘要】目的 優(yōu)選達(dá)肝清顆粒最佳的提取工藝。方法采用正交實(shí)驗(yàn)法，以人參皂苷Rg1含量及干膏率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳的提取工藝。結(jié)果達(dá)肝清顆粒最佳提取工藝為：藥材加10倍量水提取2次，1 h/次，第1次提取前先將藥材浸泡1 h。結(jié)論優(yōu)選出的達(dá)肝清顆粒的提取工藝穩(wěn)定合理可行。
【關(guān)鍵詞】達(dá)肝清顆粒； 提取工藝； 正交設(shè)計(jì)； 人參皂苷Rg1
病毒性肝炎是由多種肝炎病毒引起的常見傳染病，我國(guó)病毒性肝炎發(fā)病數(shù)位居法定管理傳染病的第一位，僅慢性乙型肝炎病毒攜帶者就達(dá)1.3億。慢性乙型肝炎病程遷延，如得不到及時(shí)的治療，將會(huì)發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，嚴(yán)重危害人類健康。達(dá)肝清顆粒原方系長(zhǎng)期用于臨床實(shí)踐的經(jīng)驗(yàn)方――達(dá)肝清湯劑。其由廣西特色藥材絞股藍(lán)、三姐妹、黃根等7味藥組成,具有清熱解毒、益氣健脾、利濕等功效。現(xiàn)代藥理研究表明達(dá)肝清有保肝降酶、抗乙肝病毒、提高免疫功能、抗肝纖維化的作用。為了將達(dá)肝清湯劑更好地應(yīng)用于臨床上，廣西中醫(yī)學(xué)院研究開發(fā)出服用、攜帶方便的達(dá)肝清顆粒劑，并對(duì)其制備工藝進(jìn)行了研究。現(xiàn)報(bào)道如下。
一、 儀器和材料
1、儀器與設(shè)備
RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）； Agilent1100（DAD、VWD）高效液相色譜儀； HB43水分測(cè)定儀（梅特勒-托利多中國(guó)地區(qū)）。
2 、 材料
絞股藍(lán)、三姐妹（三葉香茶菜）、黃根等多味藥材均購自南寧市日益旺中草藥材經(jīng)營(yíng)部，經(jīng)鑒定為正品。人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品購自中國(guó)藥品生物制品檢定所（批號(hào)：110703-200322）。
二、方法與結(jié)果
1 、考察指標(biāo)的確定
達(dá)肝清顆粒處方中有多味藥材，有效成分眾多，因此以干膏率作為考察指標(biāo)之一較全面合理，君藥絞股藍(lán)的主要有效成分為人參皂苷Rg1，故將人參皂苷Rg1作為考察指標(biāo)。
2、考察指標(biāo)的測(cè)定方法
1）干膏率的測(cè)定方法
按處方比例稱取黃根、三姐妹等藥材適量，共9份，根據(jù)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表，將藥材浸泡適當(dāng)時(shí)間后提取。提取完畢后濃縮到密度1.05 g/ml(60～70℃)，醇沉(水提液∶95%乙醇=1∶2，醇沉24 h)，棄去沉淀，得醇沉液，測(cè)量其體積，備用。將不同條件下的水提液分別濃縮至相對(duì)密度為1.20（65℃），稱重。稱取2 g，分別置于已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，并于105℃干燥至恒重，取出，置于干燥器中放置30 min，迅速精密稱定干膏重量。
干膏率（%）=干膏重×濃縮液總重取樣量×生藥總量×100%
2）人參皂苷Rg1的測(cè)定方法
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-水（20∶80）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。柱溫為35℃，流速為1 ml/min，理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)應(yīng)不低于4 000。
對(duì)照品溶液的配制：精密稱取人參皂苷Rg1適量，加甲醇溶解，制成每毫升含人參皂苷Rg1 2.03 mg的溶液，即得。
供試品溶液的配制：精密量取50 ml醇沉液放入蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，加30 ml水溶解，用水飽和正丁醇萃取3次，30 ml/次，合并萃取液，再用氨試液(氨水∶水=1∶1.5)洗兩次，40 ml/次，蒸干正丁醇，加適量甲醇溶解，將甲醇液移至10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。取部分溶液離心20 min（12 000 r/min），即得。
測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀測(cè)定其峰面積，計(jì)算人參皂苷Rg1含量。
3 、正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選提取工藝
1） 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
選擇對(duì)提取效果有重要影響的3個(gè)因素（加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)）作為考察因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，編制4因素3水平表。
2）正交實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果
按處方的一定比例稱取藥材，根據(jù)L9(34)正交表安排，分別以干膏率、人參皂苷Rg1含量為考察指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。
從以上方差分析結(jié)果可以看出：以干膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，A，B因素有顯著性影響，影響因素順序?yàn)椋築> A > C，且A2，B2，C3最佳，所以最佳工藝為A2B2C3；以人參皂苷Rg1為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，B因素有顯著性影響，影響因素順序?yàn)椋築>A>C；且A2，B2，C3最佳，所以最佳工藝為A2B2C3。綜合比較上述結(jié)果，由于C因素各水平間的差異不顯著，從實(shí)際生產(chǎn)節(jié)約時(shí)間和節(jié)約能源考慮，B因素選第2水平，A因素選第2水平， C因素選第2水平，即A2B2C2。即加10倍量水提取2次，1 h/次，第1次提取前先將藥材浸泡1 h。
4 、 最佳提取工藝驗(yàn)證
為了進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，以確保提取工藝合理可行，按上述工藝條件A2B2C2，重復(fù)安排3批試驗(yàn)。
三、討論
采用正交設(shè)計(jì)，確定了水提工藝的最佳條件，即：即稱取水提取部分藥材，加入藥材量10倍體積的水，加熱提取兩次，1 h/次。其中第1次提取前先將藥材浸泡1 h。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明提取工藝穩(wěn)定。
參考文獻(xiàn)：
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設(shè)計(jì)、改進(jìn)實(shí)驗(yàn)是有明確目的的，那就是更好地發(fā)揮實(shí)驗(yàn)在化學(xué)教學(xué)中的作用，不是為“改”而改，也不是標(biāo)新立異。因而，設(shè)計(jì)、改進(jìn)實(shí)驗(yàn)必須遵循如下的原則：
（一）以教學(xué)大綱為依據(jù)，緊密結(jié)合教材內(nèi)容
教學(xué)大綱是指導(dǎo)教學(xué)的綱領(lǐng)性文件，它規(guī)定了教學(xué)內(nèi)容的范圍和深度，實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)或增補(bǔ)，應(yīng)是嚴(yán)格遵循大綱的要求，不能“超綱”，也不能隨意降低標(biāo)準(zhǔn)。教材是教和學(xué)的依據(jù)，教材的編排循序漸進(jìn)、銜接緊密，形成了完整的科學(xué)知識(shí)體系。實(shí)驗(yàn)的編排是這一知識(shí)體系的重要組成部分。因此，實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與改進(jìn)，應(yīng)首先明確該實(shí)驗(yàn)在教材中的作用。增補(bǔ)是否有價(jià)值，是否有助于化學(xué)概念的形成，化學(xué)原理的說明，增補(bǔ)與改進(jìn)均應(yīng)在不違背教學(xué)大綱的要求，不違背教材編排科學(xué)性的前提下進(jìn)行。同時(shí)實(shí)驗(yàn)安排的時(shí)機(jī)也應(yīng)有機(jī)地溶入教材的整體之中。
（二）遵循實(shí)驗(yàn)教學(xué)自身的科學(xué)性、系統(tǒng)性
優(yōu)秀的教材在實(shí)驗(yàn)教學(xué)編排上也應(yīng)自成體系，有其自身的規(guī)律。如對(duì)儀器的認(rèn)識(shí)、使用是由簡(jiǎn)到繁、漸次增多；各種實(shí)驗(yàn)基本技能的訓(xùn)練由教師示范到學(xué)生逐步掌握應(yīng)有計(jì)劃的安排；又如對(duì)學(xué)生觀察、分析能力的培養(yǎng)也是循序漸進(jìn)的；組織學(xué)生結(jié)合教材自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)習(xí)題更應(yīng)在有一定知識(shí)及技能積累的條件下進(jìn)行。因此，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與改進(jìn)，必須遵循實(shí)驗(yàn)教學(xué)自身的規(guī)律性，違背了學(xué)生的認(rèn)識(shí)規(guī)律，就會(huì)適得其反。例如，對(duì)初中化學(xué)的增補(bǔ)與改進(jìn)實(shí)驗(yàn)，宜裝置簡(jiǎn)單、原理涉及單一，操作簡(jiǎn)便，隨著學(xué)生接觸的實(shí)驗(yàn)多了，化學(xué)知識(shí)更豐富了，再逐步提高實(shí)驗(yàn)的綜合性和復(fù)雜程度。
（三）實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與改進(jìn)，要有利于全面提高學(xué)生的素質(zhì)
前面已經(jīng)論述過，實(shí)驗(yàn)的目的，不僅在于知識(shí)的傳授和實(shí)驗(yàn)技能的訓(xùn)練，其重要作用還在于全面提高學(xué)生的素質(zhì)。目前課本上的大部分實(shí)驗(yàn)雖都經(jīng)過長(zhǎng)期教學(xué)實(shí)踐的檢驗(yàn)是行之有效的，但多數(shù)是驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。而探索性實(shí)驗(yàn)是從發(fā)展學(xué)生思維能力出發(fā)，將實(shí)驗(yàn)變成學(xué)生創(chuàng)造性學(xué)習(xí)的手段。在教師的指導(dǎo)下，通過學(xué)生親自探索新知、親自實(shí)驗(yàn)，去認(rèn)識(shí)化學(xué)概念和規(guī)律，有利于對(duì)學(xué)生進(jìn)行科學(xué)方法的初步訓(xùn)練。為此，教師要精心設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程，盡量設(shè)法提高每個(gè)實(shí)驗(yàn)的智力價(jià)值，使整個(gè)教學(xué)過程充滿啟發(fā)性、思考性。例如在初中可設(shè)計(jì)一組探究性實(shí)驗(yàn)使學(xué)生形成分子的概念及認(rèn)識(shí)分子的性質(zhì)。
（四）實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與改進(jìn)應(yīng)考慮教學(xué)法的因素
實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與改進(jìn)應(yīng)符合教學(xué)法的需要，應(yīng)有利于調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和積極性。例如，新課的講授往往以單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)為宜，復(fù)習(xí)課則可設(shè)計(jì)，增補(bǔ)綜合系列實(shí)驗(yàn)，以實(shí)驗(yàn)為線索引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行復(fù)習(xí)，如鹵素性質(zhì)綜合實(shí)驗(yàn)等。并進(jìn)實(shí)驗(yàn)課的設(shè)計(jì)應(yīng)注意如何把演示實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)化，使之儀器簡(jiǎn)單，需時(shí)少，易成功，無危險(xiǎn)。一般一節(jié)課只應(yīng)安排2～3個(gè)實(shí)驗(yàn)。
（五）力求儀器裝置簡(jiǎn)單、效果明顯、直觀性強(qiáng)
實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象應(yīng)使全班學(xué)生都能觀察到，儀器裝置簡(jiǎn)化的目的是為了突出重點(diǎn)，便于觀察。當(dāng)簡(jiǎn)單性與直觀性發(fā)生矛盾時(shí)，應(yīng)服從直觀性的需要。
（六）提高實(shí)驗(yàn)的成功率，改進(jìn)需時(shí)較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)
演示實(shí)驗(yàn)是為配合課堂教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行的，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)影響知識(shí)的講授。為保證實(shí)驗(yàn)在預(yù)定的時(shí)間內(nèi)順利完成，教師應(yīng)探究實(shí)驗(yàn)原理，尋找最佳反應(yīng)條件，研究反應(yīng)物的數(shù)量關(guān)系和形態(tài)，考慮影響實(shí)驗(yàn)的各種因素。提高實(shí)驗(yàn)成功率，使實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確及時(shí)完成，是實(shí)驗(yàn)改進(jìn)的重要課題。
（七）確保安全，防止污染
中學(xué)化學(xué)涉及一些易燃、易爆、腐蝕性強(qiáng)及有毒氣體逸出的實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中確保學(xué)生的安全，防止中毒及污染也是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與改進(jìn)的重要課題。這可從改進(jìn)儀器裝置，增加防護(hù)措施，提高實(shí)驗(yàn)技巧等多方面加以研究。
二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與改進(jìn)的思路與方法
（一）革新設(shè)計(jì)思想，巧妙構(gòu)思
實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與改進(jìn)，本身是一項(xiàng)研究，是一種創(chuàng)造。不墨守陳規(guī)，是革新與創(chuàng)造的精髓。因此，成功的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與改進(jìn)，來源于立意的創(chuàng)新、構(gòu)思的巧妙。這就要求教師在明確化學(xué)反應(yīng)原理的基礎(chǔ)上，有較廣博的知識(shí)，要熟悉化學(xué)、物理學(xué)、生物學(xué)等學(xué)科的實(shí)驗(yàn)方法，要了解國(guó)內(nèi)外化學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與改進(jìn)的動(dòng)態(tài)。下面介紹的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)是近年來中學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)改革的成果，都很有新意。
1．一氧化氮?dú)怏w簡(jiǎn)易發(fā)生器
由于一氧化氮?dú)怏w極易與空氣中的氧氣化合而生成紅棕色的二氧化氮?dú)怏w，學(xué)生難以從實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象上直觀地得出稀硝酸與銅反應(yīng)生成無色一氧化氮?dú)怏w的結(jié)論。而改進(jìn)的一氧化氮?dú)怏w簡(jiǎn)易發(fā)生器（圖16），利用一氧化氮?dú)怏w不溶于水的性質(zhì)，用稀硝酸盛滿整個(gè)試管而將空氣排出，避免了生成的一氧化氮與空氣中氧氣接觸的可能。并將一氧化氮的制備與性質(zhì)實(shí)驗(yàn)融為一體，即可清楚地看出實(shí)驗(yàn)的主要產(chǎn)物：無色的一氧化氮?dú)怏w和藍(lán)色的硝酸銅溶液，打開橡皮管夾又可演示一氧化氮與氧氣反應(yīng)生成紅棕色二氧化氮?dú)怏w，同時(shí)避免了二氧化氮?dú)怏w污染空氣。這一實(shí)驗(yàn)改進(jìn)，構(gòu)思巧妙，裝置簡(jiǎn)單，直觀性強(qiáng)，具有新穎性。
2．一氧化碳還原氧化銅實(shí)驗(yàn)
用錐形瓶或集氣瓶收集一瓶一氧化碳，將瓶口用膠塞塞緊。取粗銅絲打磨干凈后繞成螺旋狀并插入一個(gè)與瓶口合適的膠塞中。手持膠塞將銅絲加熱，離開火焰后表面要確實(shí)看到生成黑色氧化銅，趁熱插入瓶中，銅絲由黑色瞬間被還原成光亮的紅色，可重復(fù)做2～5次，倒入石灰水，石灰水變混濁證明有二氧化碳生成。
這是對(duì)原教材中實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)，儀器裝置簡(jiǎn)單，操作方便，效果明顯，易于觀察，且減少了一氧化碳的逸出。
3．吸氧腐蝕實(shí)驗(yàn)
本實(shí)驗(yàn)為增補(bǔ)課本實(shí)驗(yàn)空白而設(shè)計(jì)。可使學(xué)生直觀形象地看到吸氧腐蝕有電流產(chǎn)生，是電化腐蝕，加強(qiáng)對(duì)吸氧腐蝕機(jī)理的認(rèn)識(shí)。
實(shí)驗(yàn)裝置如圖17，將廢鋼鋸條用砂紙打亮，從中間折斷，溶液呈微酸性，pH值為6。
實(shí)驗(yàn)時(shí)，每從導(dǎo)管鼓入一次空氣流，即可看到電流計(jì)指針發(fā)生一次明顯的擺動(dòng)。此實(shí)驗(yàn)裝置簡(jiǎn)單，材料易得，操作方便省時(shí)，現(xiàn)象明顯，并可連續(xù)使用。
4．焰色反應(yīng)效果改進(jìn)實(shí)驗(yàn)
堿金屬元素的焰色反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)行教材是用鉑絲蘸取檢測(cè)液在酒精燈上灼燒觀察。由于鉑絲蘸取溶液很少，焰色反應(yīng)很快消失，學(xué)生不易看清，特別是用藍(lán)色鈷玻璃觀察鉀更困難。
若改用同時(shí)點(diǎn)多盞焰色反應(yīng)燈，能長(zhǎng)時(shí)間觀察金屬的焰色反應(yīng)。可廢物利用將青霉素藥瓶制作成焰色反應(yīng)燈。由于酒精燈用乙醇做燃料，而乙醇火焰帶黃色，對(duì)焰色有嚴(yán)重干擾。將燃料由乙醇改為甲醇，在燈芯上撒放少許粉狀檢測(cè)物，再用深色豎板做背景襯底，點(diǎn)燃燈芯，可觀察到鮮明的被測(cè)元素焰色反應(yīng)。
用滴管往小瓶?jī)?nèi)加入甲醇溶液不超過2／3容積，放入燈芯即可使用。由于點(diǎn)燈法增大了火焰的可見度，用甲醇做燃料，大大降低了對(duì)焰色反應(yīng)的嚴(yán)重干擾，即使觀察鉀的焰色也不必用鈷玻璃。燈芯上添加檢測(cè)物后，可以保持較長(zhǎng)時(shí)間使用。小瓶上要貼有標(biāo)簽，并設(shè)置瓶蓋（可用眼藥瓶底部）。
（二）采用其它學(xué)科的實(shí)驗(yàn)儀器和方法
當(dāng)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得新知識(shí)，新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，各學(xué)科之間相互滲透，相互促進(jìn)成為科技進(jìn)步的明顯特征之一。化學(xué)實(shí)驗(yàn)也不再是傳統(tǒng)的自我封閉的體系。一些其它學(xué)科儀器和電子元器件已成為廣泛通用和普及的了。根據(jù)化學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與改進(jìn)的原則和方向，引入一些新的儀器或電子元器件，對(duì)革新實(shí)驗(yàn)往往會(huì)收到事半功倍的效果。下面的一些實(shí)例，也出自各地教師的研究成果。
1．化學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)光二極管、三極管、音樂集成塊、壓電陶瓷發(fā)聲器等的應(yīng)用
半導(dǎo)體發(fā)光二極管是一種將電能轉(zhuǎn)化為光能的電子器件，具有耗電省及靈敏度高的特點(diǎn)，利用若干發(fā)光二極管和小功率晶體管可制作簡(jiǎn)單的直流放大電路。利用輸入電壓的變化，經(jīng)放大后，能使不同數(shù)的發(fā)光二極管依次發(fā)光。用此裝置可證明不同溶液導(dǎo)電能力的差異。由于不同溶液導(dǎo)電能力不同，輸入電壓也將發(fā)生相應(yīng)變化，此時(shí)發(fā)光二極管發(fā)光的個(gè)數(shù)也不同，直觀形象地說明了溶液導(dǎo)電能力的差異。
“水的電離度受溫度影響實(shí)驗(yàn)”，“金屬活潑性實(shí)驗(yàn)”，“氫氧化鋇溶液和稀硫酸溶液的中和反應(yīng)”等實(shí)驗(yàn)均可運(yùn)用上述裝置。目前，各地推薦的實(shí)驗(yàn)改進(jìn)、教具改革成果中，很多項(xiàng)目使用發(fā)光二極管、三極管等電子器件。這不僅使實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象直觀、鮮明，也開拓了學(xué)生的思路。
2．利用投影器做化學(xué)投影實(shí)驗(yàn)
在簡(jiǎn)單裝置中進(jìn)行的化學(xué)實(shí)驗(yàn)一般都可以利用投影器投影。實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象被投影放大后，使一些只有細(xì)微變化的現(xiàn)象，變得易于觀察，使遠(yuǎn)離演示臺(tái)的學(xué)生也能看清。由于投影實(shí)驗(yàn)只需在較小的器皿內(nèi)進(jìn)行，還可以節(jié)約藥品。實(shí)驗(yàn)投影的方式分為豎直投影和水平投影兩種。豎直投影時(shí)，銀幕上得到的影像是側(cè)視實(shí)驗(yàn)的效果；而水平投影時(shí)，銀幕上得到的影象是俯視實(shí)驗(yàn)時(shí)的效果，教師可根據(jù)所做實(shí)驗(yàn)在觀察上的要求來設(shè)計(jì)投影的方式。水平投影一般在結(jié)晶皿內(nèi)進(jìn)行，如金屬鈉與水反應(yīng)、電解銅等實(shí)驗(yàn)均能得到較好的效果。豎直投影實(shí)驗(yàn)，一般在扁平投影反應(yīng)槽內(nèi)進(jìn)行，可用于金屬活動(dòng)性比較、原電池、膠體電泳等實(shí)驗(yàn)。
（三）從探索最佳反應(yīng)條件上改進(jìn)實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)的研究與改進(jìn)，一種是新的構(gòu)思、新的設(shè)計(jì)，另一種則是對(duì)原教材中那些反應(yīng)條件不易掌握，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，效果不明顯的實(shí)驗(yàn)加以改進(jìn)，使之更適合教學(xué)需要。這還包括原教材中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)無可挑剔，但結(jié)合本校具體條件做起來不盡理想的。在不改變?cè)O(shè)計(jì)構(gòu)思的情況下，研究的方向主要是探索最佳的反應(yīng)條件，因?yàn)榛瘜W(xué)反應(yīng)的發(fā)生與進(jìn)行是受到多種因素制約的，首先是決定于反應(yīng)物的組成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與相互間的作用，其次還要受到外界多種因素與實(shí)驗(yàn)程序的影響。因此，化學(xué)反應(yīng)條件的研究與控制是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之一。影響化學(xué)反應(yīng)的速度與程度和實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的鮮明與準(zhǔn)確的客觀因素是眾多的。常見的客觀條件有反應(yīng)物的濃度、用量的配比、純度、溫度，反應(yīng)物間的接觸面積，反應(yīng)體系的壓強(qiáng)、溫度、光照及溶劑，反應(yīng)介質(zhì)的pH值，實(shí)驗(yàn)的程序，電化學(xué)反應(yīng)所需要的電流強(qiáng)度與電壓等等。這方面的研究與探索對(duì)提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量具有十分現(xiàn)實(shí)的意義。
1．木炭還原氧化銅實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件的研究
為得到光澤性好的塊狀金屬銅是改進(jìn)本實(shí)驗(yàn)的目的，關(guān)鍵在于研究最佳反應(yīng)條件。
首先要解決的是木炭和氧化銅的用量比，理論上，木炭與氧化銅的質(zhì)量比是1∶13．3。但若按此量，木炭的用量實(shí)際上會(huì)不足，因?yàn)樵嚬苤械目諝鈺?huì)消耗一定量木炭。因而木炭用量要比理論值偏高，實(shí)驗(yàn)證明，木炭與氧化銅質(zhì)量比以1∶10至1∶12為宜。反應(yīng)物的總量也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)效果，太多、太少均不好，如用15×150mm的試管以1.6克為宜。反應(yīng)物顆粒要細(xì)，混合均勻，適度壓實(shí)，使顆粒間緊密接觸，目的是增大反應(yīng)物的接觸面。另一課題是研究反應(yīng)溫度及燈具，由于本實(shí)驗(yàn)是固相反應(yīng)，要求使用高溫?zé)艏訜幔钜丝刂普莆盏氖鞘褂眉予F紗網(wǎng)罩的大火酒精燈，還要考慮此反應(yīng)是放熱反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)物開始發(fā)紅，猛烈燃燒時(shí)應(yīng)及時(shí)撤走酒精燈，便于觀察反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行直至反應(yīng)完全。
2．利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法研究反應(yīng)最佳條件
當(dāng)原實(shí)驗(yàn)給定的條件不詳，效果較差又無文獻(xiàn)可查時(shí)，應(yīng)利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行研究。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，簡(jiǎn)稱正交法，它利用正交表來安排試驗(yàn)。對(duì)那些受諸因素影響的實(shí)驗(yàn)，要想獲得最佳反應(yīng)條件，如果盲目試驗(yàn)，不僅增加試驗(yàn)次數(shù)，延長(zhǎng)周期，造成人力物力的浪費(fèi)，有時(shí)還會(huì)因試驗(yàn)次數(shù)多得驚人以致無法進(jìn)行。使用正交法能從眾多的不同條件搭配中，選出少量的最具“代表性”的試驗(yàn)，并能對(duì)影響試驗(yàn)結(jié)果的各個(gè)因素的重要程度給予定量的估計(jì)。正交法是一種科學(xué)方法，一項(xiàng)科學(xué)試驗(yàn)要想達(dá)到預(yù)期的目的，除了正確的指導(dǎo)思想外，采用科學(xué)方法也是試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。
（四）采用代用品，自己動(dòng)手設(shè)計(jì)制作簡(jiǎn)單的專用儀器
由于學(xué)校條件，實(shí)驗(yàn)室設(shè)備及經(jīng)費(fèi)的限制，使部分學(xué)校不能按質(zhì)按量完成教材規(guī)定的實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容。為解決這一問題，因地制宜采用代用品，自己動(dòng)手設(shè)計(jì)制作簡(jiǎn)單的儀器，是一項(xiàng)大有作為的研究課題。現(xiàn)舉幾例說明。
1．用紅磷做“自燃”實(shí)驗(yàn)
白磷劇毒，易燃，一般中學(xué)不具備保存條件。但若將一般實(shí)驗(yàn)室中易得到的紅磷轉(zhuǎn)化成白磷做自燃實(shí)驗(yàn)，不但補(bǔ)足了教材中應(yīng)做的實(shí)驗(yàn)，還擴(kuò)展了學(xué)生的知識(shí)面。
取紅磷2克裝入大試管中，把10厘米長(zhǎng)的濾紙條卷成螺旋狀裝入試管中，配上有直角導(dǎo)管的膠塞，并將導(dǎo)管插入盛有水的試管中。加熱紅磷，紅磷升華為磷蒸氣，被濾紙吸附。停止加熱，換上無孔膠塞（此時(shí)紅磷已轉(zhuǎn)化為白磷），待用。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用鑷子夾出紙條，白磷遇空氣即燃。
2．為引出催化劑概念而設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)裝置
原教材中為引出催化劑概念而設(shè)計(jì)了三個(gè)實(shí)驗(yàn)，很費(fèi)時(shí)間。現(xiàn)在用一個(gè)自制的簡(jiǎn)單儀器，可使三個(gè)實(shí)驗(yàn)用一個(gè)連續(xù)的實(shí)驗(yàn)代替。
儀器如圖18。A為自制彎曲試管，B為氯酸鉀，C為二氧化錳。實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先加熱二氧化錳，檢驗(yàn)無氧氣放出。再加熱氯酸鉀至熔化，有氧氣放出。移開火焰，使試管直立，二氧化錳落入加熱的氯酸鉀中，檢驗(yàn)有氧氣迅速放出。此實(shí)驗(yàn)由于簡(jiǎn)潔，有利于概念的引出，已被選入北京市的新編教材中。
3．二氧化碳比空氣重的實(shí)驗(yàn)
用托盤天平稱量實(shí)驗(yàn)備用的燒杯的質(zhì)量后，把集氣瓶中的二氧化碳慢慢地向燒杯里傾倒，讓學(xué)生觀看天平指針發(fā)生偏移。這一實(shí)驗(yàn)由于種種原因往往不易成功。分析原因，有時(shí)是由于實(shí)驗(yàn)室的天平被腐蝕而不夠靈敏所致；稱量與感量不匹配等。如用250毫升燒杯稱量二氧化碳和空氣，其質(zhì)量差是0.1705克，如果用感量0.2克的天平則指示不出明顯變化，所以應(yīng)當(dāng)用再大一些的容器。再有集氣瓶的體積也應(yīng)與燒杯的體積相匹配，集氣瓶的體積應(yīng)等于或大于燒杯的體積，容器是否干燥也很重要。為了提高演示成功率，可改成一種自制天平。將懸有兩個(gè)紙袋的杠桿支架起來并保持平衡，將其懸掛在鐵架臺(tái)上。用大燒杯收集滿二氧化碳，然后將二氧化碳慢慢傾注到一端的紙袋里。杠桿失去平衡時(shí)，再向另一端的紙袋里倒入二氧化碳，杠桿又恢復(fù)平衡。本著就地取材，因陋就簡(jiǎn)的精神，可制作多種實(shí)用的儀器。如用廢牛皮紙信封做成漏斗，再涂以蠟或樹脂涂料實(shí)用且不易摔碎。用易拉罐，有機(jī)玻璃、泡沫板，聚光電珠等制作高亮度丁達(dá)爾現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)器，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象十分明顯；用135膠卷暗盒制作的酒精燈增溫護(hù)焰罩，能使酒精充分燃燒，焰高是原來的1．5～2倍，處于半氣化狀態(tài)，加罩的酒精燈適用于木炭還原氧化銅、甲烷制取、焰色反應(yīng)等高溫實(shí)驗(yàn)。其它一些代用品或廢棄物如輸液管、塑料瓶等均可派上用場(chǎng)。
4．液封除毒氣化學(xué)儀器的自制
