時(shí)間：2023-05-30 09:25:12
開(kāi)篇：寫(xiě)作不僅是一種記錄，更是一種創(chuàng)造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇細(xì)胞免疫，希望這些內(nèi)容能成為您創(chuàng)作過(guò)程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進(jìn)步。
摘 要 自1981年Siegel提出細(xì)胞免疫系統(tǒng)的新概念以來(lái)[1]，紅細(xì)胞免疫在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。紅細(xì)胞不僅作為人體血液中重要的組成成分，在人體免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮著舉足輕重的作用。本文對(duì)紅細(xì)胞免疫功能、測(cè)定方式進(jìn)行說(shuō)明的同時(shí)，也對(duì)近年來(lái)運(yùn)動(dòng)對(duì)紅細(xì)胞免疫的影響做進(jìn)一步的概括。
關(guān)鍵詞 運(yùn)動(dòng) 紅細(xì)胞 免疫研究
一、紅細(xì)胞的免疫功能
國(guó)內(nèi)外對(duì)紅細(xì)胞的免疫功能做了大量研究，現(xiàn)在已經(jīng)趨于成熟。紅細(xì)胞重要的免疫功能與自身免疫物質(zhì)是分不開(kāi)的。紅細(xì)胞主要的免疫物質(zhì)有：補(bǔ)體受體CR1、淋巴細(xì)胞功能抗原-3、人類(lèi)補(bǔ)體膜輔助因子蛋白、過(guò)氧化酶、過(guò)氧化物歧化酶、降介加速因子、I因子、紅細(xì)胞免疫粘附抑制因子、紅細(xì)胞免疫粘附促進(jìn)因子。其免疫作用主要有以下幾點(diǎn)。
（一）粘附、清除免疫復(fù)合物
紅細(xì)胞免疫功能重要的物質(zhì)基礎(chǔ)是補(bǔ)體受體CR1，即紅細(xì)胞C3b|C4b受體[2]。正常紅細(xì)胞表面 CR1 能夠黏附抗原—抗體—補(bǔ)體形成的免疫復(fù)合物以及抗原補(bǔ)體復(fù)合物。CR1是單鏈糖蛋白，在紅細(xì)胞膜上成簇存在，它可以與循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC）中的C3b可逆結(jié)合，這種結(jié)合受CR1濃度的影響。結(jié)合免疫復(fù)合物以后的紅細(xì)胞（RBC-IC）隨血液到達(dá)肝、脾后，肝、脾中的巨噬細(xì)胞的CR1濃度比紅細(xì)胞的高，可將IC從低濃度CR1的紅細(xì)胞上奪取過(guò)來(lái)，進(jìn)行吞噬。紅細(xì)胞與IC分離后重新進(jìn)入血液。此外，CR1通過(guò)免疫復(fù)合物抗體的Fc段與吞噬細(xì)胞的Fc段受體結(jié)合，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用[3]。因此，CR1的橋梁作用使紅細(xì)胞在粘附、清除免疫復(fù)合物時(shí)起重要作用。
（二）發(fā)揮自身免疫效應(yīng)
紅細(xì)胞膜上的CR1與C3b結(jié)合后，自身釋放某些酶（比如過(guò)氧化物酶和氧化酶）殺傷紅細(xì)胞表面的微生物。
（三）參與特異性免疫與非特異性免疫調(diào)節(jié)
紅細(xì)胞上的免疫物質(zhì)通過(guò)特異性或非特異性免疫參與調(diào)控。紅細(xì)胞不僅對(duì)抗原呈遞、加工，還可產(chǎn)生NK細(xì)胞增強(qiáng)因子，增強(qiáng)NK細(xì)胞的毒效應(yīng)，在抗感染、抗腫瘤及保護(hù)機(jī)體重要蛋白質(zhì)和DNA免遭氧化損傷中其重要作用[4]。紅細(xì)胞促進(jìn)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2受體，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的免疫功能。此外，紅細(xì)胞促進(jìn)B 細(xì)胞增殖和免疫球蛋白Ig的合成，這種作用是同LFA-3與T細(xì)胞的CD3分子相互作用，T 細(xì)胞的CD3分子增強(qiáng)B細(xì)胞應(yīng)答。
（四）參與自身細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)控
體外實(shí)驗(yàn)表明，紅細(xì)胞可促進(jìn)自身單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IL-3，集落刺激因子，IL-6，IL-8a，腫瘤壞死因子，IL-1等細(xì)胞因子[5]。其主要機(jī)制是紅細(xì)胞膜表達(dá)的CD58分子，是單個(gè)核細(xì)胞表面CD2分子的天然配體，二者結(jié)合是紅細(xì)胞具有調(diào)控作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。紅細(xì)胞上存在大量IL-8受體（即Duffy血型抗原），該受體能將血中的IL-8等趨化因子迅速地從血漿中清除掉，IL-1、IL-6 和TNF等炎癥細(xì)胞因子的作用必須以IL-8因子為中介。因此，內(nèi)環(huán)境中IL-8分子的濃度與炎癥發(fā)生的快慢及嚴(yán)重程度有重要關(guān)系。
三、紅細(xì)胞免疫測(cè)定的指標(biāo)
（一）紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)實(shí)驗(yàn)
紅細(xì)胞C3b花環(huán)率主要測(cè)定紅細(xì)胞C3b受體（即CR1）的活性，根據(jù)其活性變化反映紅細(xì)胞免疫功能的狀況。CR1在紅細(xì)胞發(fā)揮粘附清除功能時(shí)發(fā)揮重要作用。因此CR1的活性的高低是反映紅細(xì)胞免疫能力強(qiáng)弱的一個(gè)敏感且具有代表性的指標(biāo)。C3b一方面共價(jià)結(jié)合與抗原或免疫復(fù)合物，另一方面有作為配體與細(xì)胞表面的受體CR1相結(jié)合，觸發(fā)免疫細(xì)胞對(duì)異物及抗原的黏附和清除[6]。紅細(xì)胞 C3b受體花環(huán)率主要測(cè)定其活性，根據(jù)其活性的變化反映紅細(xì)胞免疫功能的狀況。
（二）紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率
紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率主要測(cè)定紅細(xì)胞黏附免疫復(fù)合物的能力，并間接反映出循環(huán)免疫復(fù)合物的水平變化。免疫復(fù)合物可以激活補(bǔ)體，產(chǎn)生的C3b轉(zhuǎn)脂反應(yīng)后可以嵌入到免疫復(fù)合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中形成紅細(xì)胞免疫復(fù)合物，并被紅細(xì)胞CR1識(shí)別、粘附。形成的免疫復(fù)合物占據(jù)CR1的位點(diǎn)，所以紅細(xì)胞免疫復(fù)合物實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映的是免疫復(fù)合物通過(guò)CR1-C3b聯(lián)結(jié)結(jié)合于紅細(xì)胞上的情況。形成的免疫復(fù)合物越多紅細(xì)胞的免疫能力越低。
四、不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)紅細(xì)胞免疫的影響
（一）長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)與紅細(xì)胞免疫
長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)使紅細(xì)胞免疫力下降。裴新貞等[7]得出的結(jié)論：長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，SD大鼠的紅細(xì)胞免疫粘附功能下降?？赡艿脑蚴情L(zhǎng)時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，機(jī)體處于高氧狀態(tài)，氧自由基過(guò)多，使紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，紅細(xì)胞流變性發(fā)生變化。大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)使血液中β-內(nèi)啡肽增多，而紅細(xì)胞上有β-內(nèi)啡肽受體即阿片肽。實(shí)驗(yàn)證明，β-內(nèi)啡肽對(duì)紅細(xì)胞粘附作用有正負(fù)調(diào)節(jié)作用，β-內(nèi)啡肽與阿片肽結(jié)合而改變CR1構(gòu)象，從而調(diào)節(jié)CR1粘附作用。
（二）適中強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)與紅細(xì)胞免疫
張利朝等人指出紅細(xì)胞免疫能力與紅細(xì)胞數(shù)量有一定的關(guān)系[8]；田石榴[9]等通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究也得出適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)量會(huì)提高紅細(xì)胞的免疫指數(shù)。前人的報(bào)告結(jié)論是一致的，這些對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練提供一定的理論指導(dǎo)。
（三）力竭運(yùn)動(dòng)與紅細(xì)胞免疫功能
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間劇烈至力竭運(yùn)動(dòng)后引發(fā)繼發(fā)性的免疫功能下降從而造成SD大鼠繼發(fā)性紅細(xì)胞免疫功能下降，且長(zhǎng)時(shí)間未能恢復(fù)至安靜時(shí)水平，處于免疫抑制狀態(tài)[10]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，長(zhǎng)時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)損害機(jī)體免疫能力，表現(xiàn)為對(duì)感染性疾病的易感性增加，從而使運(yùn)動(dòng)員的健康水平和運(yùn)動(dòng)能力發(fā)生不同程度的下降。
目前，國(guó)內(nèi)、外對(duì)運(yùn)動(dòng)與紅細(xì)胞免疫功能研究還有待深入進(jìn)行研究，了解運(yùn)動(dòng)中紅細(xì)胞的免疫功能的變化及其恢復(fù)特點(diǎn)，對(duì)科學(xué)地指導(dǎo)大眾健身運(yùn)動(dòng)、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與體育教學(xué)具有重要的意義。
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【關(guān)鍵詞】腫瘤;細(xì)胞免疫療法;分子生物學(xué)
機(jī)體免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞已被許多實(shí)驗(yàn)明確證實(shí)。細(xì)胞免疫療法通過(guò)提取人體最有力攻破癌細(xì)胞的免疫細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)、擴(kuò)增、激活，使其具有識(shí)別和殺死腫瘤細(xì)胞的能力后再回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)，通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力的方式來(lái)抑制或消除腫瘤的生物細(xì)胞免疫療法。近年來(lái)的研究顯示，以免疫治療為主體的腫瘤生物治療已被公認(rèn)為繼手術(shù)、放療和化療后的腫瘤治療的第四模式，其療效已在多種腫瘤的治療中得到驗(yàn)證。本文就細(xì)胞免疫療法在臨床多種癌癥治療中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。
1過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療白血病
細(xì)胞免疫治療成為白血病治療中一個(gè)迅速發(fā)展的領(lǐng)域。Armstrong等曾將白血病的細(xì)胞免疫治療大致分為兩類(lèi)：一是輸注可在體內(nèi)刺激抗白血病活性的細(xì)胞，即疫苗治療；二是輸注有內(nèi)在抗白血病活性的免疫效應(yīng)細(xì)胞，即過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療。有學(xué)者用腫瘤特異抗原（TSA）/腫瘤相關(guān)抗原（TAA）的某些肽段致敏腫瘤患者緩解期自身T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性CTL，在體外可有效殺傷患者自身腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常造血細(xì)胞無(wú)毒作用。Sprent等報(bào)道了DC來(lái)源的exosomes能在體外直接誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增，因此認(rèn)為其在體外擴(kuò)增抗原特異性CTL方面具有重要的理論和臨床應(yīng)用價(jià)值。喬建輝等在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道DSI能促進(jìn)異基因造血干細(xì)胞移植后供者嵌合體的增加，有利于供者細(xì)胞植入，而且具有并發(fā)癥少，較好的GVL效應(yīng)等優(yōu)勢(shì)。最近一項(xiàng)針對(duì)半相合移植后復(fù)發(fā)患者的DSI臨床報(bào)道顯示，20例復(fù)發(fā)患者中有8例達(dá)到完全緩解，平均生存1118d，治療效果比較滿(mǎn)意。
2肺癌的細(xì)胞免疫療法
免疫治療是肺癌綜合治療的主要手段之一，細(xì)胞免疫治療通過(guò)給機(jī)體輸注抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞的方法來(lái)達(dá)到治療腫瘤的目的。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床資料表明，IL一2／LAK細(xì)胞療法具有抑制瘤、殺傷瘤作用。近來(lái)，Ebina將BAK療法應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的治療。該研究提示具有免疫活性的NSCLC患者更適合BAK療法。BAK細(xì)胞治療可糾正免疫功能低下，有利于延長(zhǎng)NSCLC患者的生存期，提高生存質(zhì)量。TIL細(xì)胞治療結(jié)腸直腸癌、惡性黑色素瘤與腎細(xì)胞癌已顯示一定的臨床療效。近年來(lái)，CD3 AK細(xì)胞抗腫瘤作用的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展。楊新靜等將CIK細(xì)胞用于肺癌的治療研究，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)體外制備的CIK細(xì)胞不僅增殖速度快，而且對(duì)肺癌細(xì)胞體內(nèi)外均具有高效的殺傷活性。
3卵巢癌的免疫治療
卵巢癌是女性生殖器常見(jiàn)惡性腫瘤之一，近年來(lái)，有關(guān)卵巢癌免疫治療方面的研究較多。Bjorge等指出，因?yàn)槁殉舶┰谶h(yuǎn)處轉(zhuǎn)移前的相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)都存在于腹膜腔內(nèi)，并且卵巢癌術(shù)后遺留微小病變細(xì)胞處于休眠狀態(tài)或至少處于低代謝率，所以卵巢癌非常適用于局部單克隆抗體的免疫治療。過(guò)繼細(xì)胞免疫治療，其優(yōu)點(diǎn)是繞過(guò)了機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤抗原的免疫耐受效應(yīng)。Lambeck等研究了在卵巢癌患者體內(nèi)的p53特異性T細(xì)胞反應(yīng)，表明卵巢癌患者體內(nèi)存在一種弱的混合型輔T細(xì)胞，即p53特異性T細(xì)胞可以誘導(dǎo)p53特異Thl／CTL免疫，其研究結(jié)果支持了使用p53長(zhǎng)肽作為瘤苗免疫策略的理論。卵巢癌的免疫治療仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段和部分臨床前期研究階段，需對(duì)腫瘤特異抗原、機(jī)體抗腫瘤免疫、腫瘤化療與免疫治療的時(shí)序等基礎(chǔ)和臨床問(wèn)題進(jìn)行更深入的研究。
4EBV病毒特異性CTL治療鼻咽癌
鼻咽癌細(xì)胞表達(dá)HLA I類(lèi)分子，抗原遞呈機(jī)制正常。鼻咽癌病人外周血中存在EBV特異性CTL，具備細(xì)胞免疫治療的基礎(chǔ)。Chua等報(bào)告EBV特異性多克隆CTL(5×107―3x108)治療4例晚期鼻咽癌病人，除外周血EBV拷貝數(shù)降低外，沒(méi)有觀察到腫瘤縮小。Straathof等報(bào)告6例復(fù)發(fā)性／難治性鼻咽癌病人接受EBV特異性多克隆CTL(2×107／m2-2×10S／m2)后，CR 2例，PR 2例，SD l例，PD 1例。5例病人的外周血EBV拷貝數(shù)在6周內(nèi)明顯降低，另1例在治療前沒(méi)有檢測(cè)到EBV。EBV特異性多克隆CTL輸注沒(méi)有明顯毒副作用。生物治療技術(shù)的進(jìn)步使鼻咽癌患者獲得更多治療機(jī)會(huì)，但是，鼻咽癌是地區(qū)性疾病。受到國(guó)際社會(huì)的關(guān)注程度有限，需要更多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)來(lái)證實(shí)生物治療對(duì)鼻咽癌的有效性。
隨著腫瘤分子生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展，已能在體外培養(yǎng)出許多種類(lèi)不同的特異性和非特異性的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，尤其是腫瘤抗原的鑒定和合成、四聚體檢測(cè)及分揀以及DC細(xì)胞的培養(yǎng)，使得能在體外成功地培養(yǎng)出大量的腫瘤特異性CTL細(xì)胞，真正開(kāi)始了主動(dòng)免疫和過(guò)繼性免疫相結(jié)合的腫瘤特異性免疫治療。細(xì)胞免疫治療將與傳統(tǒng)的腫瘤治療(手術(shù)，化、放療)和新的治療方法如基因治療、抗血管生成治療等相聯(lián)合，使其在腫瘤治療中發(fā)揮重要的作用。
參考文獻(xiàn)
【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞免疫治療； 過(guò)繼性免疫治療
【中圖分類(lèi)號(hào)】R473.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1003-8183（2013）11-0087-02
腫瘤是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病之一，傳統(tǒng)的腫瘤治療手段，包括手術(shù)、化療與放療，由于不能殺死全部腫瘤細(xì)胞，多數(shù)患者仍不能免于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的發(fā)生 。作為現(xiàn)代腫瘤治療的第 4種模式，腫瘤的細(xì)胞免疫治療被越來(lái)越多的患者接受。細(xì)胞免疫治療是指向腫瘤患者輸注具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞， 通過(guò)直接殺傷腫瘤或激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞達(dá)到治療腫瘤的目的。本文將對(duì)腫瘤細(xì)胞免疫治療中的部分細(xì)胞作一簡(jiǎn)要介紹。
1 LAK細(xì)胞
Grimm 等首先證明使用 IL-2 能夠激活人外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生 LAK 細(xì)胞（淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞），這類(lèi)細(xì)胞對(duì)人腫瘤細(xì)胞系具有殺傷功能。Rosenberg等首次應(yīng)用 LAK細(xì)
胞/IL-2 聯(lián)合治療晚期轉(zhuǎn)移性腎癌和黑色素瘤取得了較好的效果，大約15-20%的腫瘤患者表現(xiàn)為部分緩解或完全緩解[1]。LAK細(xì)胞抗腫瘤具有如下特點(diǎn)：前體細(xì)胞具有異質(zhì)性，包括 NK細(xì)胞和 T 細(xì)胞；發(fā)揮殺傷活性不需要抗原的致敏，并無(wú)組織相容性抗原的限制；可以殺傷對(duì) NK 細(xì)胞不敏感的腫瘤細(xì)胞，但對(duì)正常細(xì)胞無(wú)殺傷作用；殺傷作用需要細(xì)胞因子的激活，以IL-2的激活作用最強(qiáng)。LAK細(xì)胞是目前應(yīng)用較廣、療效明確的腫瘤過(guò)繼性細(xì)胞治療方法。
2 CIK細(xì)胞
細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer cells， CIK細(xì)胞）是由細(xì)胞因子在體外誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞而獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞， CIK細(xì)胞兼具 T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和 NK 細(xì)胞的非 MHC 限制性殺瘤等優(yōu)點(diǎn)，并且具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣及對(duì)正常骨髓造血前體細(xì)胞毒性小等特點(diǎn)。NKT 細(xì)胞和 CTL 細(xì)胞是 CIK 細(xì)胞中對(duì)
腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用的主要成分。下面分別介紹一下這兩種細(xì)胞的作用機(jī)制及研究現(xiàn)狀。
2.1 NKT細(xì)胞：NKT細(xì)胞是同時(shí)具有 T細(xì)胞和NK細(xì)胞特點(diǎn)的淋巴細(xì)胞，與CD4+和 CD8+T細(xì)胞需要識(shí)別抗原肽不同，NKT細(xì)胞可以識(shí)別合成的糖脂抗原、α-神經(jīng)酰胺和MHCⅠ類(lèi)分子?；罨蟮?NKT細(xì)胞可以表現(xiàn)出對(duì)多種腫瘤NK樣的細(xì)胞毒活性，作用機(jī)制包括穿孔素/顆粒酶，F(xiàn)as 配體，或腫瘤壞死因子（TNF）相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）等細(xì)胞死亡誘導(dǎo)方式[2]。臨床研究表明，利用 NKT細(xì)胞治療多發(fā)性骨髓瘤、肺癌、頭頸部腫瘤等實(shí)體瘤取得了較好的治療效果。
2.2 CTL 細(xì)胞：細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL細(xì)胞）是機(jī)體抗腫瘤反應(yīng)中最主要的效應(yīng)細(xì)胞，由腫瘤特異性抗原激活并賦予其抗腫瘤的特異性。臨床試驗(yàn)中，用外周血淋巴細(xì)胞來(lái)源的 CTL細(xì)胞用于治療晚期轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，取得了顯著的治療效果，但CTL細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用需要腫瘤細(xì)胞表達(dá)其特異性的抗原，丟失特異性抗原的腫瘤細(xì)胞無(wú)法被 CTL細(xì)胞識(shí)別而繼續(xù)生長(zhǎng)，表達(dá)特異性抗原的正常細(xì)胞可以被特異性的 CTL細(xì)胞殺傷，這就影響了 CTL細(xì)胞治療腫瘤的應(yīng)用。
3 TIL 細(xì)胞
腫瘤浸潤(rùn) T淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL細(xì)胞）是一群存在于腫瘤間質(zhì)中的異質(zhì)性淋巴細(xì)胞， 在體內(nèi)聚集到腫瘤部位的能力強(qiáng)于LAK和NK，僅殺傷其抗原特異性的腫瘤細(xì)胞，而對(duì)其他組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞無(wú)殺傷作用。但有研究表明，TIL細(xì)胞對(duì)腫瘤患者的臨床治療效果不佳，這可能與治療前患者的體內(nèi)免疫狀態(tài)有關(guān)。如果使用 TIL細(xì)胞進(jìn)行過(guò)繼轉(zhuǎn)輸治療前，使用化療藥物對(duì)患者進(jìn)行預(yù)處理，可以增強(qiáng) TIL 細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)[3]。體外分離、 擴(kuò)增腫瘤特異性T細(xì)胞的技術(shù)問(wèn)題嚴(yán)重影響臨床實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展，僅有30%-40%的組織標(biāo)本可以分離得到足夠的 T 細(xì)胞，并且整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程復(fù)雜、繁瑣，需要大量的人力、物力，并且需要大約6 周的時(shí)間才能夠?qū)崿F(xiàn) T細(xì)胞的回輸。
4 基因修飾的T 細(xì)胞
使用體外擴(kuò)增的 LAK、CIK或 TIL細(xì)胞進(jìn)行過(guò)繼轉(zhuǎn)輸用于腫瘤的治療雖然取得了一定的抗腫瘤效果，但是由于體外分離和擴(kuò)增技術(shù)的問(wèn)題使 TIL 細(xì)胞應(yīng)用受到了一定的限制。 基因修飾的 T細(xì)胞可以解決上述問(wèn)題，即將抗體對(duì)腫瘤抗原的高度親和性和T淋巴細(xì)胞的殺傷機(jī)制相結(jié)合，利用工程技術(shù)構(gòu)建表達(dá)嵌合受體的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，體外轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，然后過(guò)繼回輸?shù)襟w內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用。使用 anti-MART-1 TCR 修飾的 T 細(xì)胞治療黑色素瘤患者，15 例受試者中有 2 例患者的 T 細(xì)胞僅在體外培養(yǎng) 6-9 天進(jìn)行回輸，表現(xiàn)出較好的抗腫瘤反應(yīng)?；蛐揎桾細(xì)胞過(guò)繼回輸可能存在一些安全性問(wèn)題，針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，有研究者采用 TK 自殺基因在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候?qū)δ切┻^(guò)量的 T 細(xì)胞進(jìn)行自我毀滅。
5 結(jié)語(yǔ)
腫瘤的細(xì)胞免疫治療關(guān)鍵問(wèn)題在于尋找到安全有效的免疫效應(yīng)細(xì)胞，如治療中使用的T 細(xì)胞應(yīng)靶向多個(gè)腫瘤靶點(diǎn)、具有復(fù)合抗癌機(jī)制、能在體內(nèi)長(zhǎng)期存活，并建立高效快速的 T 細(xì)胞體外篩選擴(kuò)增技術(shù)；相信隨著研究的深入，這些技術(shù)問(wèn)題將會(huì)逐步解決，腫瘤免疫治療也將取得更大的成功。
參考文獻(xiàn)
[1] 程民. 一種新的人NK細(xì)胞系的建立、特征及抗腫瘤效應(yīng)研究[D]. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2010
CIK細(xì)胞，即細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)是一種新型的免疫活性細(xì)胞，CIK增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞毒作用強(qiáng)，具有一定的免疫特性。該細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力很強(qiáng)，如同“細(xì)胞導(dǎo)彈”，能精確“點(diǎn)射"腫瘤細(xì)胞，但不會(huì)傷及“無(wú)辜”的正常細(xì)胞。尤其對(duì)手術(shù)后或放化療后患者效果顯著，能消除殘留微小的轉(zhuǎn)移病灶，防止癌細(xì)胞擴(kuò)散和復(fù)發(fā)，提高機(jī)體免疫力，因此，CIK細(xì)胞被認(rèn)為是新一代的腫瘤過(guò)繼細(xì)胞免疫治療的首選方案。我科從2007年8月至2009年8月應(yīng)用CIK細(xì)胞免疫治療107例惡性腫瘤患者，取得了良好的療效?，F(xiàn)將治療中的護(hù)理體會(huì)介紹如下。
1 臨床資料
1.1 一般資料 本組病例共107例，男64例，女43例，年齡34～81歲。其中肺癌39例，乳腺癌24例，肝癌12例，前列腺癌8例，胰腺癌6例，胃癌5例，腎癌4例，惡黑3例，其他惡性腫瘤6例。
1.2 治療方法 患者在簽好知情同意書(shū)后，使用細(xì)胞分離機(jī)采集外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，將采集到的單個(gè)核細(xì)胞加入含有多種細(xì)胞因子的培養(yǎng)液中培養(yǎng)約10天左右，此時(shí)其總數(shù)量擴(kuò)增至(4.6～7.8)108個(gè)，再把擴(kuò)增后細(xì)胞加入生理鹽水中分4天經(jīng)靜脈回輸患者體內(nèi)。
2 護(hù)理措施
2.1 采血前護(hù)理
2.1.1 心理護(hù)理 詳細(xì)向患者及家屬介紹CIK細(xì)胞免疫治療的方法、療效和注意事項(xiàng)，介紹成功病例，鼓勵(lì)患者樹(shù)立戰(zhàn)勝病魔的信心，消除不良情緒，積極配合治療。
2.1.2 評(píng)估 包括患者的病情、意識(shí)狀態(tài)、生命體征、血管的充盈情況，及患者的理解和配合能力。
2.1.3 飲食 采血前2～3天勿食油膩飲食，給高蛋白、高熱量、高維生素、低脂飲食，采血前飲適量溫開(kāi)水。
2.2 采血時(shí)護(hù)理 由醫(yī)生開(kāi)出醫(yī)囑，經(jīng)二人核對(duì)醫(yī)囑，認(rèn)真查對(duì)床號(hào)、姓名、住院號(hào)，確認(rèn)無(wú)誤后方可采血。嚴(yán)格無(wú)菌操作，選擇粗大彈性好的血管，保證采血通暢，避免速度過(guò)快，以防血管負(fù)壓太大，血流不暢，致采血量不足。采集過(guò)程中監(jiān)測(cè)生命體征，觀察有無(wú)頭暈、乏力、心慌不適等情況，發(fā)現(xiàn)異常及時(shí)處理。
2.3 采血后護(hù)理 采血結(jié)束拔管后，立即按壓穿刺點(diǎn)，按壓時(shí)間10～15min。隨時(shí)觀察穿刺點(diǎn)有無(wú)出血情況，告知患者合理飲食，生活規(guī)律，預(yù)防感冒，等待細(xì)胞回輸。
2.4 回輸時(shí)的護(hù)理 認(rèn)真查對(duì)床號(hào)、姓名、住院號(hào)，嚴(yán)格無(wú)菌操作， 用一次性輸血器回輸，以過(guò)濾細(xì)胞碎片。輸注前充分搖勻，防止細(xì)胞凝集?；剌斍?0min肌肉注射鹽酸異丙嗪12.5～25mg，預(yù)防不良反應(yīng)的發(fā)生。為保證細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量，輸注前后均用0.9%生理鹽水沖洗輸血器管路。輸注時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，開(kāi)始輸注時(shí)速度為20滴/分鐘，觀察10min后無(wú)不良反應(yīng)，可將滴數(shù)調(diào)為60～80滴/分鐘，30min內(nèi)輸完，以保證細(xì)胞的活性。加強(qiáng)巡視，觀察患者有無(wú)發(fā)熱、心慌、胸悶、皮疹、皮膚瘙癢等癥狀。發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)立即停止輸注，并及時(shí)處理。放療、化療期間不進(jìn)行細(xì)胞回輸，防止放療、化療殺傷CIK細(xì)胞，影響療效。
2.5 回輸后護(hù)理 如果病人需要反復(fù)多次治療，必須告訴病人下次治療的時(shí)間，提前1d辦入院，做好治療前的各項(xiàng)檢查工作，如心電圖，抽血檢查血常規(guī)、肝功能，同時(shí)科室要做好床位安排工作，確保病人下一次治療的順利進(jìn)行。
關(guān)鍵詞： CIK細(xì)胞 免疫治療 惡性腫瘤
繼手術(shù)、放化療之后，細(xì)胞免疫治療腫瘤已受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注，而輸注細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量是保證臨床療效的關(guān)鍵[1]，因此，如何在體外培養(yǎng)出高增殖高活性的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)[2]。CIK細(xì)胞是一種免疫殺傷細(xì)胞，具有高增殖和高細(xì)胞毒性，能特異性殺傷腫瘤細(xì)胞?，F(xiàn)將本院應(yīng)用CIK細(xì)胞治療85例腫瘤患者的近期療效報(bào)告如下。
1、材料與方法
1.1臨床資料
我院在2012年到2013年，對(duì)85例惡性腫瘤病人行CIK細(xì)胞回輸，其中男53例，女32例；年齡26歲到75歲，其中肝癌10例，胃癌19例，乳腺癌18例，肺癌31例，食道癌7例。
1.2試劑與儀器
淋巴細(xì)胞分離液：中國(guó)科學(xué)院生物工程研究所；RPMI1640培養(yǎng)基：美國(guó)wigma公司；IL-2：英國(guó)pepro tech公司；IFN-γ：英國(guó)pepro tech公司；CD3：美國(guó) Ancell Corporation公司。低溫高速離心機(jī)：英國(guó)Beck man公司；HF212 UV CO2恒溫培養(yǎng)箱：上海力申科技有限公司；倒置相差顯微鏡：日本Olympus公司。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
采用淋巴細(xì)胞分離液分離患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，懸浮于1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，第一天加入IFN-γ（1000U/ml）20μl，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中；24 小時(shí)后，加CD3 單抗（ 100mg/mL）100μl，IL-2（500μ/mL）40μl；72 小時(shí)后，補(bǔ)加培養(yǎng)液和IL-2。培養(yǎng)第3天時(shí)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果陰性后，洗滌注入100mL生理鹽水回輸給患者。
2、結(jié)果
患者接受CIK細(xì)胞免疫過(guò)繼治療后，T細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)和絕對(duì)值均明顯提高，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3、CD8、CD56與輸注前對(duì)比，70%患者有所提高，20%患者無(wú)改變，10%患者降低。絕大部分患者食欲得到改善，睡眠障礙減輕，疼痛得到緩解。
3、討論
我院自體CIK細(xì)胞回輸治療85例惡性腫瘤患者，絕大部分患者治療有效，患者回輸CIK細(xì)胞后感覺(jué)明顯好轉(zhuǎn)。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)T細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)和絕對(duì)值提高者達(dá)70%，有效改善了患者的生命體征，提高了患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)了患者的生存時(shí)間，為腫瘤患者提供了更加有效的治療手段。
CIK細(xì)胞在醫(yī)學(xué)上被稱(chēng)為腫瘤的細(xì)胞導(dǎo)彈，它識(shí)別腫瘤的能力強(qiáng)，且不會(huì)殺傷人體的正常免疫細(xì)胞[3]。CIK細(xì)胞作為目前生物治療的新手段，其殺瘤活性強(qiáng)，且無(wú)明顯的毒副作用，已經(jīng)越來(lái)越受到人們的重視，給越來(lái)越多的患者帶來(lái)福音[4]。
參考文獻(xiàn)：
[1]李敏， 鄧海峰， 陸明洋， 等. CIK治療前后腫瘤患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞變化研究. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)， 2011，6（15）：1051-1053.
[2]田靜， 盧紅， 宿向東， 等. CIK細(xì)胞治療放化療后腫瘤患者的臨床觀察. 腫瘤預(yù)防與治療， 2009，3（23）：269-271.
【摘要】 為了研究骨髓增生異常綜合征（MDS）患者骨髓原始細(xì)胞免疫表型特征，應(yīng)用四色流式細(xì)胞術(shù)對(duì)常規(guī)設(shè)門(mén)及二次設(shè)門(mén)策略選取的29例MDS患者的骨髓細(xì)胞懸液中，CD34+細(xì)胞進(jìn)行免疫表型分析。結(jié)果表明： ①隨著MDS的進(jìn)展（RA/RASRAEBRAEB-T），根據(jù)CD45/SSC圖中選取的原始細(xì)胞群中，CD34+細(xì)胞比例逐漸增高，分別為8.0%、46.4%、76.8%，各亞型之間差別有顯著意義（P
【關(guān)鍵詞】 骨髓增生異常綜合征
Four-color Flow Cytometric Immunophenotypic Features of Blasts in Myelodysplastic Syndromes
AbstractThis study was aimed at exploring
the immunophenotypic features of blasts in patients with myelodysplastic syndromes (MDS). Four-color flow cytometry using conventional and secondary gating strategies was used to immunophenotype blasts and the CD34 positive cells in bone marrow nucleated cells of 29 patients with MDS. The results showed: (1) with progression of MDS from RA/RAS，RAEB to RAEB-T，the proportion of CD34+ cells were gradually increased from 8.0%，46.4% to 76.8% (P
Key words myelodysplastic syndrome；immunophenotype；four-color flow cytometry；CD34+ cell
骨髓增生異常綜合征（MDS）是一組起源于造血干/祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病，以外周血一系或多系細(xì)胞減少，骨髓一系或多系病態(tài)造血和高風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)展成急性髓細(xì)胞白血病為特征。我們應(yīng)用一組單克隆抗體、四色六參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)和常規(guī)和/或二次設(shè)門(mén)策略提取原始細(xì)胞、CD34陽(yáng)性（CD34+）細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行了免疫表型分析，以期為臨床提供合理的診斷和治療依據(jù)。
材料和方法
病例選擇
29例MDS患者，男17例，女12例，年齡20-71歲，其中RA/RAS 17例、RAEB 6例和RAEB-T 6例。MDS的診斷參照《血液病診斷與療效標(biāo)準(zhǔn)》（張之南，第2版）。
材料
單克隆抗體包括HLA-DR-FITC、CD15-FITC、CD2-FITC、CD10-FITC、CD20-FITC、CD33-PE、CD13-PE、CD7-PE、CD19-PE、CD117-PE、CD34-ECD和CD45-PY5等及其相應(yīng)的標(biāo)記熒光素的同型對(duì)照，所有單克隆抗體均為法國(guó)Immunotech公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀為Beckman-Coulter公司的Epics XL 型，采用Expo32-ADC分析軟件。
骨髓原始細(xì)胞的表達(dá)
對(duì)29例MDS患者同時(shí)進(jìn)行了形態(tài)學(xué)及免疫分型檢測(cè)，其中26例(89.7%)形態(tài)學(xué)診斷為MDS，此26例骨髓原始細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上和流式細(xì)胞術(shù)上所占百分比見(jiàn)表1，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。余3例（10.3%）形態(tài)學(xué)無(wú)法診斷的患者免疫分型均提示為RA/RAS。Table 1. Correlation between analysis of flow cytometry and morphology in 26 cases（略）
流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)
新鮮抽取的肝素抗凝骨髓（6小時(shí)內(nèi)），調(diào)整細(xì)胞數(shù)至（0.5-1）×106/ml，分6管標(biāo)記抗體后，行流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)定。6管抗體組合分別為CD15/CD33/CD34/CD45、HLA-DR/CD13/CD34/CD45、CD2/CD7/CD34/CD45、CD10/CD19/CD34/CD45、CD20/CD117/CD34/CD45及陰性對(duì)照管IgG1-FITC/IgG1-PE/IgG1-ECD/CD45-PC5。
常規(guī)的分析方法
在CD45 vs SSC散點(diǎn)圖上，至少分析10 000個(gè)細(xì)胞，取常規(guī)原始細(xì)胞的位置設(shè)A門(mén)后對(duì)A門(mén)細(xì)胞行不同抗原表達(dá)的分析（圖1）。
二次設(shè)門(mén)分析方法
T門(mén)為在CD34直方圖上對(duì)A門(mén)原始細(xì)胞上行二次設(shè)門(mén)取得的CD34+原始細(xì)胞群，對(duì)T門(mén)細(xì)胞行不同抗原表達(dá)的分析（圖2）。
結(jié)果判定
抗原表達(dá)結(jié)果為各標(biāo)本管抗原表達(dá)率減去陰性對(duì)照管自發(fā)熒光表達(dá)率。CD34>5%，髓系、淋系抗原>20%為陽(yáng)性。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理t檢驗(yàn)。
結(jié) 果
免疫表型表達(dá)
29例MDS各種抗原表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表2和表3。表2顯示常規(guī)方法直接對(duì)原始細(xì)胞設(shè)門(mén)后的表達(dá)結(jié)果，表3顯示二次設(shè)門(mén)后各種抗原在CD34+原始細(xì)胞上的表達(dá)結(jié)果。
CD34在原始細(xì)胞中的表達(dá)
隨著RA/RASRAEBRAEB-T的進(jìn)展，CD34+細(xì)胞比例逐漸增高，分別為8.0%、46.4%和76.8%，各亞型之間差別有顯著意義（P
兩種分析方法抗原表達(dá)
檢測(cè)結(jié)果顯示，兩種分析方法均異常表達(dá)HLA-DR及髓系抗原，不表達(dá)淋系相關(guān)抗原。常規(guī)獲取的原始細(xì)胞隨著RA/RASRAEBRAEB-T的進(jìn)展，HLA-DR、CD13、CD33和CD117表達(dá)逐漸增高，CD15表達(dá)逐漸減低，差別均有顯著意義（P
討論
MDS具有高度的異質(zhì)性，病變過(guò)程涉及多個(gè)基因及經(jīng)歷多個(gè)復(fù)雜階段。根據(jù)最新的世界衛(wèi)生組織(WHO)分型標(biāo)準(zhǔn)，已將其列為髓系造血系統(tǒng)惡性腫瘤的一種［1］。為了更好地和國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行對(duì)比，客觀反映MDS的生物學(xué)特征與臨床的相關(guān)性，我們沿用了FAB的分型標(biāo)準(zhǔn)，將MDS分為RA/RAS 、RAEB 和RAEB-T。結(jié)果顯示，雖然原始細(xì)胞在形態(tài)學(xué)所占百分比略高于流式細(xì)胞分析結(jié)果，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），考慮為流式檢測(cè)中溶血及少量細(xì)胞碎片所致，CD34在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中的表達(dá)與文獻(xiàn)一致［2-5］，早期干/祖細(xì)胞抗原CD34的異常表達(dá)與MDS的進(jìn)展有關(guān)，29例MDS隨著RA/RASRAEBRAEBT的進(jìn)展，CD34+細(xì)胞比例進(jìn)行性增高，分別為8.0%、46.4%、76.8%，證明了在早期MDS階段，惡性克隆性CD34+原始細(xì)胞已經(jīng)存在，MDS的進(jìn)展過(guò)程就是惡性克隆呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)性生長(zhǎng)擴(kuò)增的過(guò)程。
MDS原始細(xì)胞特征性地表達(dá)CD34+ HLA-DR+CD13+CD33+［4］。文獻(xiàn)所分析的原始細(xì)胞均常規(guī)選取低SSC且CD45弱表達(dá)的原始細(xì)胞區(qū)域［2，4-6］，但實(shí)際這一部位包含了正常及異常原始細(xì)胞，所得結(jié)果缺乏標(biāo)準(zhǔn)性。我們利用的CD34+細(xì)胞在正常骨髓中0.05）。我們認(rèn)為，隨著MDS由低危向高危的進(jìn)展，正常的原始細(xì)胞隨著異常的原始細(xì)胞數(shù)逐漸增高，比例將呈相對(duì)的減少，尤其在RA/RAS中，異常原始細(xì)胞比例低，難以形成獨(dú)立的細(xì)胞群體，按常規(guī)分析的結(jié)果很難反映MDS的異質(zhì)性和惡性克隆的真正表型特征。
許多學(xué)者［2，4-6］采用常規(guī)的分析方法后，得出部分抗原表達(dá)隨著CD34的增高出現(xiàn)相應(yīng)異常變化這一結(jié)論（HLA-DR、CD13、CD33和CD117表達(dá)逐漸增高，而CD15表達(dá)則逐漸降低），由此認(rèn)為與病情進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)，而經(jīng)過(guò)二次設(shè)門(mén)所分析的結(jié)果表明，抗原表達(dá)的異常并沒(méi)有隨MDS的進(jìn)展而發(fā)生明顯變化（P>0.05），即單純憑借抗原表達(dá)不能對(duì)病情預(yù)后和治療效果的預(yù)示提供幫助。我們認(rèn)為，CD34的增高雖與MDS的進(jìn)展有關(guān)，但這只是反映優(yōu)勢(shì)惡性克隆數(shù)量上的增加，而不能真正觸及疾病的進(jìn)展本質(zhì)。
雖然細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)一直是診斷MDS的金標(biāo)準(zhǔn)，但在實(shí)際細(xì)胞分類(lèi)工作中會(huì)由于病態(tài)造血類(lèi)型多且缺乏公認(rèn)的量化標(biāo)準(zhǔn)以致易于忽略，而文獻(xiàn)報(bào)道異常染色體核型的檢出率也僅為40%-70%［8］。在我們檢測(cè)的29例病例中有3例（10.3%）形態(tài)學(xué)無(wú)法診斷，22例（75.9%）細(xì)胞遺傳學(xué)無(wú)法提示。而流式細(xì)胞術(shù)具有高度的敏感性，可以檢測(cè)到>10-4的早期惡性克隆，從而更廣泛地捕獲異常細(xì)胞，尤其對(duì)全血細(xì)胞減少及骨髓纖維化的樣本，流式細(xì)胞術(shù)較細(xì)胞形態(tài)學(xué)更能顯示其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
Maynadie等［5］分析了207例MDS患者和68例正常對(duì)照骨髓樣品中原始細(xì)胞的免疫表型，結(jié)果MDS原始細(xì)胞高表達(dá)CD34及 CD36，而正常對(duì)照原始細(xì)胞低或不表達(dá)CD34及CD36，他們認(rèn)為MDS中CD34的異常表達(dá)代表原始細(xì)胞的不成熟性和異質(zhì)性。我們同意Kristensen等［9］觀點(diǎn)，在臨床高度懷疑但形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)不能診斷時(shí)，免疫表型將作為MDS（特別是RA）的重要診斷指標(biāo)，因此當(dāng)骨髓CD34+細(xì)胞≥1.5%，免疫表型檢測(cè)結(jié)果對(duì)MDS的診斷更具意義。
參考文獻(xiàn)
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在肝癌的治療中，T細(xì)胞免疫在腫瘤免疫中起著重要的作用。盡管肝癌組織存在淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，但是這并沒(méi)有使肝癌的病情進(jìn)展速度減緩。所以關(guān)于淋巴細(xì)胞在腫瘤患者體內(nèi)的功能變化特別是T淋巴細(xì)胞在肝癌患者體內(nèi)的免疫作用值得進(jìn)一步的研究。目前，一直缺少一個(gè)有效而且特異性強(qiáng)的研究模型。從而造成研究的影響宿主免疫狀態(tài)因素增多，增加了研究的難度。本研究在裸鼠體內(nèi)建立起一個(gè)以T細(xì)胞免疫功能重建為基礎(chǔ)的模型，為進(jìn)一步進(jìn)行免疫與腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
1資料和方法
1.1細(xì)胞系與培養(yǎng) 小鼠高淋巴高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株（Hca-P）和低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株（Hca-F）購(gòu)于大連醫(yī)科大學(xué)。在含有10%小牛血清的RPMI1640（Invitrogen，LifeTech.，美國(guó)）中，置于37℃、含有5%CO 2 溫箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代?；蛘呓臃N于615小鼠腹腔，4天后形成腹水，取腹水，分離腫瘤細(xì)胞傳代。
1.2動(dòng)物的飼養(yǎng) BALB/c nu/nu雄性裸小鼠，4-6周齡，體重20g左右，置于層流式超凈架內(nèi)的有機(jī)玻璃飼養(yǎng)盒內(nèi)（5只/盒），在恒溫（25-27℃）、恒濕（45-50%）、無(wú)特殊病原菌（SPF）級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。滅菌處理的水和飼料供動(dòng)物自由攝入。
615小鼠，雄性，4-6周齡，體重20g左右，飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
1.3小鼠T淋巴細(xì)胞的提取 取2只4周齡Balb/c雄性小鼠，引頸處死，無(wú)菌取胸腺，放于不含小牛血清的RPMI1640中，于200目金屬網(wǎng)上研壓，收集網(wǎng)下細(xì)胞懸液注入無(wú)菌離心管中，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次并重新懸浮。
將懸浮的細(xì)胞再次離心，計(jì)數(shù)，與淋巴細(xì)胞分離 液（1.077A，批號(hào):10110487，AXIS-SHIELD PoC AS，Norway）按照細(xì)胞懸液:分離液=2∶1的體積小心將細(xì)胞懸液加于分離液上方，分層放置。再于600g水平離心20min。小心取出離心管，吸取中間的單個(gè)核細(xì)胞層，用PBS重新懸浮，并計(jì)數(shù)。
將分離的單個(gè)核細(xì)胞用T淋巴細(xì)胞分離柱（CEDARLANE，Canada）進(jìn)行分離，方法詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。收集分離到的T淋巴細(xì)胞，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。
1.4 T淋巴細(xì)胞免疫體系在裸鼠體內(nèi)的建立 取42只Balb/c nu/nu雄性裸小鼠，分為4組。分別是高轉(zhuǎn)移重建組（P1），高轉(zhuǎn)移未重建組（P2），低轉(zhuǎn)移重建組（F1），低轉(zhuǎn)移未重建組（F2）。第1天取T淋巴細(xì)胞分別經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)。每只小鼠0.3ml，含細(xì)胞數(shù)量為（6～8）×10 6 個(gè)。此后，每周尾靜脈注射T淋巴細(xì)胞1次，3周后處死小鼠。
1.5 T細(xì)胞免疫功能重建效果的評(píng)價(jià) 淋巴細(xì)胞表型的鑒定:分別取高、低轉(zhuǎn)移組的小鼠的外周血淋巴細(xì)胞以及脾細(xì)胞（分離方法同上），配制成大約1×10 6 /ml，按照10 6 細(xì)胞量加入10μl小鼠CD3、CD4、CD8流式抗體（eBioscience Inc.），避光反應(yīng)30分鐘后，流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson，USA）檢測(cè)CD3、CD4、CD8細(xì)胞的百分比。每組隨機(jī)抽取7例樣本進(jìn)行檢測(cè)。
1.6淋巴細(xì)胞功能的檢測(cè) 采用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。分別于無(wú)菌條件下取兩只免疫重建后的裸鼠脾臟以及未進(jìn)行免疫功能重建的裸鼠脾臟，按照上述程序分離單個(gè)核細(xì)胞。進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
1.7統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS11.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析以及秩和檢驗(yàn)。
2結(jié)果
2.1 T細(xì)胞免疫功能重建前后細(xì)胞表面標(biāo)志物的變化 裸鼠T細(xì)胞免疫功能重建后的CD4/CD8與對(duì)照組相比有明顯的差異（P
圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞免疫功能重建前后裸鼠外周血淋巴
細(xì)胞標(biāo)志物變化
2.2 T細(xì)胞免疫功能重建前后免疫細(xì)胞功能檢測(cè)見(jiàn)表2。免疫功能正常的接種高（P）、低（F）轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的T細(xì)胞與相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)后，其cpm值均低于未重建組的cpm值。其中在高轉(zhuǎn)移組（P組）的cpm值明顯小于對(duì)照組（P
3討論
腫瘤的轉(zhuǎn)移與免疫之間的關(guān)系一直是研究的熱點(diǎn)之一。肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)與基因的突變有關(guān)，也與機(jī)體的免疫狀態(tài)有關(guān) ［1，2］ 。肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的研究將建立在生物學(xué)的基礎(chǔ)上，在治療方面，肝癌根治性切除 后生物治療可能占重要地位，尤其是在提高機(jī)體免疫功能方面。不論從整體角度研究免疫治療還是在微觀角度研究，對(duì)肝癌而言，均需要建立一個(gè)可以進(jìn)行研究的模型。
目前，研究者建立了各種模型進(jìn)行腫瘤轉(zhuǎn)移的研究 ［3-8］ 。關(guān)于肝癌轉(zhuǎn)移研究的模型也進(jìn)行了探討 ［9］ ，但是關(guān)于肝癌免疫研究的模型目前尚缺乏。本研究利用T細(xì)胞免疫功能重建在裸鼠體內(nèi)建立起一種新型研究的模型。該模型利用正常Balb/c小鼠的胸腺細(xì)胞建立在無(wú)胸腺的Balb/c nu/nu裸鼠體內(nèi)，具有以下特點(diǎn):①兩種小鼠種系相同，高、低轉(zhuǎn)移的細(xì)胞株亦是小鼠來(lái)源，排除了MHC限制性對(duì)研究的影響;②本模型在裸鼠體內(nèi)較為單純地模擬了T細(xì)胞免疫功能的重建，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)裸鼠的外周血和脾臟T淋巴細(xì)胞的表達(dá)，證實(shí)了該免疫重建模型的有效性;③本研究利用胸腺細(xì)胞進(jìn)行免疫功能重建，可以較好的模擬免疫環(huán)境，便于深入進(jìn)行研究?？梢詾榻窈筮M(jìn)一步進(jìn)行腫瘤免疫方面的研究提供參考。
但是在研究中我們發(fā)現(xiàn)，免疫重建后裸鼠外周血及脾臟T淋巴細(xì)胞絕對(duì)比例數(shù)值不高，淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞功能并不理想。分析可能系以下原因:①采集標(biāo)本的時(shí)間與重建時(shí)間間隔較長(zhǎng)或免疫功能重建所用胸腺中native T細(xì)胞進(jìn)行陽(yáng)性選擇大量死亡所致;②肝癌細(xì)胞是否存在殺傷免疫細(xì)胞的機(jī)制尚不清楚，但是腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞的抑制作用已經(jīng)有大量的研究 ［10，11］ ;③本免疫重建模型建立的方法還不夠完善，有待于進(jìn)一步摸索。此亦為今后模型進(jìn)一步改進(jìn)的方向。但是，該模型的建立為深入研究肝癌轉(zhuǎn)移的免疫學(xué)因素及手段提供了實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
【參考文獻(xiàn)】
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福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院腫瘤外科，福建福州 350000
[摘要] 目的 探討益氣養(yǎng)陰湯對(duì)圍手術(shù)期胃癌患者細(xì)胞免疫功能的影響。方法 選擇胃癌根治術(shù)患者60例，隨機(jī)方法分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組兩組。兩組分別于服藥前1 d、術(shù)后第1天、第7天檢測(cè)細(xì)胞免疫指標(biāo)CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+。 結(jié)果 術(shù)后第1天患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均較術(shù)前有所下降，使用益氣養(yǎng)陰湯患者術(shù)后第1天、術(shù)后第7天CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+等細(xì)胞免疫指標(biāo)恢復(fù)較快，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），兩組病人治療期間均未出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥。結(jié)論 益氣養(yǎng)陰湯可明顯增強(qiáng)圍手術(shù)期胃癌患者細(xì)胞免疫功。
關(guān)鍵詞 益氣養(yǎng)陰湯；圍手術(shù)期；胃癌；細(xì)胞免疫
[中圖分類(lèi)號(hào)] R273 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2014）09（a）－0045-03
[基金項(xiàng)目]福建省教育廳B類(lèi)課題資助（JB11073）。
[作者簡(jiǎn)介] 萬(wàn)勇（1983-），男，福建光澤人，研究生，醫(yī)師，研究方向:胃腸腫瘤臨床。
[通訊作者] 陳江田（1960.-），男，福建大田人，本科，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向:消化道腫瘤基礎(chǔ)及臨床研究，Email:nniu20000@163.com。
胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前以外科手術(shù)治療為主，配合化療、放療、免疫治療等治療。但術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的胃癌患者在臨床上也很常見(jiàn)[1]。當(dāng)前我國(guó)胃癌防治現(xiàn)狀是“三低一高”:即早期診斷率低(約10%)，手術(shù)切除率低(<70%)，5年生存率低〔約40%)，根治術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高(約50%)[2]。胃癌最有效的治療方法仍然是手術(shù)切除，但是胃癌病人即使能根治性切除，術(shù)后總的五年生存率也僅有60%左右[3],多數(shù)病人死于術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。研究表明機(jī)體細(xì)胞免疫功能是影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的重要因素之一，尤其影響腫瘤治療效果和預(yù)后。所以增強(qiáng)患者圍手術(shù)期免疫機(jī)能對(duì)胃癌患者預(yù)后有著重要的影響。T細(xì)胞亞群分析是常用重要細(xì)胞免疫檢測(cè)項(xiàng)目，對(duì)評(píng)價(jià)機(jī)體免疫狀態(tài)具有重要的臨床意義。為探討益氣養(yǎng)陰湯對(duì)圍手術(shù)期胃癌患者細(xì)胞免疫功能的影響，現(xiàn)將2013年1月—2014年5月期間的益氣養(yǎng)陰湯對(duì)圍手術(shù)期胃癌患者細(xì)胞免疫功能的臨床療效觀察，現(xiàn)報(bào)道如下。
1資料與方法
1.1一般資料
收集2013年1月—2014年5月在福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院腫瘤科住院行胃癌手術(shù)的患者60例。實(shí)驗(yàn)組30例，其中男性16例，女性14例。平均年齡67.8歲。對(duì)照組30例，其中男性12例，女性18例。平均年齡69.3歲。
1.2病例納入標(biāo)準(zhǔn)
①年齡18~75歲。②經(jīng)病理學(xué)診斷為胃癌，根據(jù)AJCC（美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)）的分期標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)CT等術(shù)前檢查可行手術(shù)的胃癌患者。③未接受過(guò)其它任何輔助治療。
1.3病例排除標(biāo)準(zhǔn)
①既往有化療，放療，生物治療、綜合免疫治療史。②胃癌晚期患者不適合手術(shù)治療。③過(guò)敏體質(zhì)、對(duì)多種藥物過(guò)敏者。④不符合納入標(biāo)準(zhǔn)，未按規(guī)定用藥，無(wú)法判斷療效或資料不全等影響療或安全性判斷者。⑤兼有重度高血壓、重度心肺功能不全、重度心律失常，肝、腎、肺、腦、甲狀腺和血液等系統(tǒng)嚴(yán)重原發(fā)性疾病，精神病患者。符合以上標(biāo)準(zhǔn)任意一項(xiàng)者即可排除。
1.4主要藥物與試劑
益氣養(yǎng)陰湯：黃芪30 g、靈芝30 g、女貞子15 g、淮山藥15 g,由人民醫(yī)院制劑室濃煎至100 mL。
1.5研究方法
1.5.1研究對(duì)象分組根據(jù)上述納入標(biāo)準(zhǔn)篩選胃癌患者60例，再根據(jù)隨機(jī)方法分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組兩組。實(shí)驗(yàn)組30例，其中男16例，女14例。平均年齡67.8歲。對(duì)照組30例，其中男12例，女18例。平均年齡69.3歲。
1.5.2給藥方法實(shí)驗(yàn)組:術(shù)前7 d開(kāi)始予溫度約37 ℃左右的益氣養(yǎng)陰湯100 mL，2次/d，于術(shù)后24 h后開(kāi)始經(jīng)胃管緩慢注入溫度約37 ℃左右的益氣養(yǎng)陰湯，煎劑100 mL,推注時(shí)間約20 min,推注結(jié)束后夾閉胃管30 min,間隔8 h后,再注入1次。2 次/d,直至患者排氣后,拔除胃管,改口服相應(yīng)劑量的益氣養(yǎng)陰湯,2 次/d,連用7 d。并于術(shù)后第1天、第7天留取外周靜脈血，測(cè)細(xì)胞免疫功能。
對(duì)照組: 用藥方法同實(shí)驗(yàn)組，將生理鹽水取代益氣養(yǎng)陰湯。
胃管下端置于吻合口下20 cm 左右遠(yuǎn)端空腸內(nèi),術(shù)后均常規(guī)給予營(yíng)養(yǎng)支持治療以保證每日熱卡需求，但不得使用其他中藥制劑。
1.6細(xì)胞免疫功能檢測(cè)
分別于服藥前1 d，術(shù)后第1天、第7天留取外周靜脈血，測(cè)細(xì)胞免疫指標(biāo)CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+使用流式細(xì)胞儀測(cè)定。
1.7統(tǒng)計(jì)方法
采用spss13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)。
2結(jié)果
2.1臨床結(jié)果
治療及觀察期間，兩組患者住院天數(shù)、手術(shù)創(chuàng)傷、輸血量、使用抗生素天數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均按照計(jì)劃完成治療。
2.2細(xì)胞免疫指標(biāo)測(cè)定結(jié)果
兩組病人術(shù)后第1天CD3+、CD4+、CD4+/CD8+ 比值較術(shù)前均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。圍手術(shù)期應(yīng)用益氣養(yǎng)陰湯術(shù)后第7天CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值均有所升高，與應(yīng)用生理鹽水對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。
3討論
在臨床實(shí)踐中，該院認(rèn)識(shí)到圍手術(shù)期應(yīng)用益氣養(yǎng)陰湯能夠增強(qiáng)患者機(jī)體免疫力，有利于患者術(shù)后的早期恢復(fù)。所以該院從細(xì)胞免疫的角度出發(fā)，來(lái)研究胃癌圍手術(shù)期服用益氣養(yǎng)陰湯對(duì)患者免疫功能的影響。
手術(shù)后大約1周時(shí)間是機(jī)體免疫機(jī)能受到極度抑制的時(shí)期,機(jī)體殘存癌細(xì)胞在此期內(nèi)可以擺脫機(jī)體免疫功能的束縛,加速通過(guò)血道、淋巴道及局部種植播散轉(zhuǎn)移,增加胃癌,尤其是進(jìn)展期胃癌術(shù)后的復(fù)發(fā)率,影響生存率和治愈率[4]。機(jī)體的免疫狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),而T 細(xì)胞亞群介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在抗腫瘤發(fā)生的免疫監(jiān)視功能中起主要作用,機(jī)體以T 細(xì)胞為中心的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)直接影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后,因此檢測(cè)T 細(xì)胞亞群水平對(duì)估計(jì)腫瘤患者的免疫功能水平有較為直接的指導(dǎo)意義[5]。路小光研究表明[6]：胃癌病人的細(xì)胞免疫功能處于抑制狀態(tài)，手術(shù)切除原發(fā)癌瘤，盡管部分患者未能達(dá)到根治目的，也能使機(jī)體免疫狀態(tài)得到緩解，術(shù)后1周所表現(xiàn)的細(xì)胞免疫功能幾近衰竭，可能造成癌瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，強(qiáng)調(diào)手術(shù)前后應(yīng)對(duì)病人的免疫狀態(tài)加以保護(hù)。所以目前對(duì)增強(qiáng)胃癌患者圍手術(shù)期間免疫功能的研究國(guó)內(nèi)學(xué)者進(jìn)行了很多有益的探索，目前在這一領(lǐng)域研究較多的為腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)胃癌患者術(shù)后免疫功能影響，研究證明圍手術(shù)期采用腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，能夠有利于病人術(shù)后免疫功能的恢復(fù)和疾病的預(yù)后[7-8]。吳彬等研究表明[9]，同手術(shù)后單獨(dú)應(yīng)用腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)相比,圍手術(shù)期聯(lián)合應(yīng)用中藥的腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)具有顯著的細(xì)胞免疫增強(qiáng)作用, 可有效糾正胃癌患者術(shù)后細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)。在復(fù)方中藥的應(yīng)用研究方面易：昆昆等研究表明[10]早期使用香砂六君湯,可扭轉(zhuǎn)患者因手術(shù)后創(chuàng)傷與麻醉導(dǎo)致的患者細(xì)胞免疫功能的深入抑制,增強(qiáng)患者術(shù)后的細(xì)胞免疫功能,可能對(duì)提高術(shù)后患者的生存期有重要的臨床意義。
該研究發(fā)現(xiàn)，兩組胃癌圍手術(shù)期患者術(shù)后第1天CD3+、CD4+比值下降，CD8+比值上升，繼而導(dǎo)致CD4+/CD8比值下降。說(shuō)明胃癌患者術(shù)后免疫水平受抑制，可能機(jī)制為一方面胃腫瘤術(shù)后腫瘤負(fù)荷減低，可解除機(jī)體對(duì)細(xì)胞免疫的抑制，另一方面手術(shù)本身對(duì)機(jī)體來(lái)說(shuō)是一個(gè)打擊，可抑制免疫細(xì)胞的合成及釋放，術(shù)后細(xì)胞免疫水平低下，近期易于發(fā)生各種感染、遠(yuǎn)期可能導(dǎo)致腫瘤亞臨床灶的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。而術(shù)后第7天患者CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值均有所升高，與應(yīng)用生理鹽水對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。從中該院得到的啟示，術(shù)后第7天患者細(xì)胞免疫得到不同程度的恢復(fù)， 通過(guò)早期腸內(nèi)給予益氣養(yǎng)陰湯能使患者細(xì)胞免疫得到顯著改善。從細(xì)胞免疫的角度來(lái)說(shuō)，CD4+、CD8+分別存在于THT細(xì)胞（誘導(dǎo)-輔T細(xì)胞）和TCT細(xì)胞（抑制-殺傷性T細(xì)胞）。CD4+、CD8+數(shù)量可間接反映THT細(xì)胞、TCT細(xì)胞數(shù)量，CD4+/CD8+比值間接反映了THT/TCT比值，保持CD4+/CD8+比值穩(wěn)定，可有效糾正胃癌術(shù)后細(xì)胞免疫受抑制狀態(tài)，從而減少近期感染幾率和遠(yuǎn)期亞臨床灶的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)幾率。
西醫(yī)學(xué)在提高患者圍手術(shù)期免疫力方面主要為生物免疫制劑，價(jià)格昂貴，給患者造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且臨床效果并不理想。中醫(yī)藥是我國(guó)特有的治療方法,傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為“正氣存內(nèi)，邪不可干”、“邪能傷正,正能勝邪”,益氣養(yǎng)陰湯根據(jù)祖國(guó)醫(yī)學(xué)理論和辨證施治原則,由生黃芪、女貞子、靈芝、懷山藥等有效中草藥組成。在臨床的應(yīng)用中，該院發(fā)現(xiàn)，在圍手術(shù)期應(yīng)用此方，能有效增強(qiáng)患者的機(jī)體免疫力，能達(dá)到“扶正祛邪”的目的。能有效抑制患者術(shù)后殘余腫瘤細(xì)胞的增殖擴(kuò)散，能在一定程度上防止胃癌術(shù)后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。研究推廣中藥在胃癌圍手術(shù)期的應(yīng)用，有利于減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，提高臨床療效。并且也是對(duì)中醫(yī)藥防治胃癌進(jìn)行初步探討。
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[關(guān)鍵詞] 抑肽酶；體外循環(huán)；紅細(xì)胞；免疫
[中圖分類(lèi)號(hào)] R392 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B[文章編號(hào)]1673-7210（2007）12（b）-111-01
抑肽酶(aprotinin)是廣譜絲氨酸蛋白酶抑制劑，可與蛋白酶形成可逆的酶抑制劑，能使CPB過(guò)程中激肽酶系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)等不被激活，具有顯著的抗纖溶、保護(hù)血小板，減少CPB術(shù)中、術(shù)后出血，降低機(jī)體在各種應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的炎性反應(yīng)的藥理作用，且作用與劑量相關(guān)，其作為血液保護(hù)的一種有效手段廣泛用于CPB心臟手術(shù)[1]。
1 材料與方法
1.1病例選擇
隨機(jī)選取非發(fā)紺型先天性心臟病擇期首次CPB心臟直視手術(shù)患兒26例(CPB時(shí)間31~75 min)，男性14例，女性12例，年齡1~15歲，ASAⅡ~Ⅲ級(jí)，心功能Ⅰ~Ⅱ級(jí)，其中房間隔/室間隔(ASD/VSD)修補(bǔ)術(shù)22例，其他4例。將入選病例隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(A組，n=6)，小劑量抑肽酶組(B組，n=10)，50 000 000IU/kg，大劑量抑肽酶組(C組，n=10)，100 000 000IU/kg。麻醉誘導(dǎo)后靜脈注射抑肽酶實(shí)驗(yàn)劑量10 000 000IU/kg，血壓(SBP)降低
1.2方法
將患者隨機(jī)分成用抑肽酶組與對(duì)照組，分別于誘導(dǎo)后切皮前(T1)、轉(zhuǎn)流15 min和30 min (T2和T3) ，CPB開(kāi)始后2 h(T4)、術(shù)畢24 h(T5)抽取動(dòng)脈血，測(cè)定紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率(RBC-3bRR)、紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率(RBC-ICR)水平。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，所得數(shù)據(jù)按照Taylor公式進(jìn)行校正。P
2 結(jié)果
CPB對(duì)紅細(xì)胞免疫黏附功能的影響：CPB開(kāi)始后，三組T2~T5時(shí)點(diǎn)RBC-C3bRR水平均較T1時(shí)點(diǎn)顯著下降(P
各組間比較顯示A組RBC-C3bRR水平T3~T5時(shí)點(diǎn)較B組明顯下降(P
3 討論
我們的研究結(jié)果證實(shí)了CPB及手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)RBC-CRI造成了嚴(yán)重器質(zhì)性損傷，表現(xiàn)為CPB轉(zhuǎn)流后三組RBC-C3bRR下降和RBC-ICR升高，RBC免疫功能紊亂，術(shù)后24 h仍未恢復(fù)到術(shù)前水平。CPB后RBC有明顯皺縮、變形改變(25％~40%)，并隨CPB時(shí)間延長(zhǎng)而加重，CRI的破壞使其表達(dá)量減低，不能有效地調(diào)理補(bǔ)體和C3b-IC，使其免疫調(diào)控和黏附功能降低。而缺血再灌注后體內(nèi)OFR生成增多和機(jī)體抗氧化能力的下降，RBC內(nèi)鈣、鈉超負(fù)荷，ATP酶活性異常可能造成RBC-CRI表達(dá)量下降的重要因素。
紅細(xì)胞CRI是一種糖蛋白，其活性能被胰酶、糜蛋白酶所破壞。糜蛋白酶在血中保持一定活性，預(yù)充液中加抑肽酶，在體外循環(huán)早期對(duì)糜蛋白酶活性起抑制作用，使CRI破壞減少，但隨體外循環(huán)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑肽酶的作用減弱，C3b受體活性逐漸降低，而紅細(xì)胞膜黏附免疫復(fù)合物的功能無(wú)明顯變化，CIC的攝取、清除能力下降，表現(xiàn)為紅細(xì)胞免疫功能紊亂[2，3]。我們觀察到抑肽酶組T2~T4時(shí)點(diǎn)RBC-C3bRR下降和RBC-ICR升高均較對(duì)照組有顯著意義(P
大劑量抑肽酶較小劑量抑肽酶更能保護(hù)CPB過(guò)程中RBC免疫功能，改善RBC-CRI表達(dá)量及ECKR結(jié)合活性。雖然我們的研究結(jié)果和對(duì)照組相比，抑肽酶對(duì)體外循環(huán)中的氧自由基，IL-8含量和RICRR均有明顯的降低效果，且對(duì)RBC-CRI表達(dá)量及ECKR結(jié)合活性均有明顯的保護(hù)作用，但抑肽酶組的眾多的指標(biāo)在體外循環(huán)轉(zhuǎn)機(jī)15 min后的各時(shí)間段均有明顯高于轉(zhuǎn)機(jī)前的表現(xiàn)，說(shuō)明體外循環(huán)對(duì)機(jī)體帶來(lái)的炎性反應(yīng)的復(fù)雜性和嚴(yán)重性，單獨(dú)使用抑肽酶似不能完全有效地消除體外循環(huán)對(duì)機(jī)體的炎性反應(yīng)，而應(yīng)采取綜合措施。
[參考文獻(xiàn)]
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【摘要】 目的 探討月見(jiàn)草花兩種提取物對(duì)免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫功能的影響。方法 小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，Cy)50mg/kg建立免疫抑制模型，然后將月見(jiàn)草花兩種提取物分別以高、中、低三個(gè)劑量(低劑量437.5mg/kg、中劑量875mg/kg和高劑量1750mg/kg)每天1次灌胃，觀察對(duì)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor α，TNF-α)和干擾素-γ(Interferon γ，IFN-γ)分泌水平的影響。結(jié)果 月見(jiàn)草花的兩種中劑量提取物均可增加免疫抑制小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)刺激指數(shù)(SI值 P
【關(guān)鍵詞】 月見(jiàn)草花;小鼠;細(xì)胞免疫
月見(jiàn)草(Oenothera biennis L)，又名夜來(lái)香，為柳葉菜科月見(jiàn)草屬植物。我國(guó)自1936年引種后，在黑龍江、吉林、遼寧、江蘇、江西和寧夏等分布廣泛，做為油藥植物大面積栽培[1]。月見(jiàn)草的食藥兩用性以及美容效果在國(guó)際中已有廣泛共識(shí)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，月見(jiàn)草有卓越的抗炎，抗氧化，抗血栓，降血脂，抗腫瘤，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[2]，緩解經(jīng)前癥候群[3]，減肥及抗衰老等作用[4]。本文旨在觀察月見(jiàn)草花兩種提取物對(duì)環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫的影響。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠，8周齡，體重18～22g，雌雄各半，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 月見(jiàn)草花為寧夏產(chǎn)月見(jiàn)草的干花(購(gòu)于寧夏榮康月見(jiàn)草種植基地)，乙酸乙酯(Ethylacetate，EAc)提取物是經(jīng)乙醇提取后再用乙酸乙酯提取的浸膏，每克浸膏生藥含量為148g;水提取物采用煎煮法制備浸膏，每克浸膏生藥含量為23g。環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，Cy)為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品。綿羊紅細(xì)胞、豚鼠血清(寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，小鼠TNF-α、IFN-γ檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司提供)，ConA、MTT、RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma公司產(chǎn)品)。
1.2 方法
1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法 ICR小鼠80只，隨機(jī)分為8組，每組10只，雌雄各半。第1組為正常對(duì)照組：每日用生理鹽水20mL/kg灌胃1次，共8d;第2組為模型組：每日用生理鹽水灌胃1次，于第5天腹腔注射Cy 50mg/kg;第3、4、5組為月見(jiàn)草花乙酸乙酯提取物組：分別按低劑量437.5mg/kg、中劑量875mg/kg和高劑量1750mg/kg每天灌胃1次，持續(xù)8d，并于第5天腹腔注射Cy 50mg/kg;第6、7、8組為月見(jiàn)草花水提取物組：分別按低劑量437.5mg/kg、中劑量875mg/kg和高劑量1750mg/kg每天灌胃1次，持續(xù)8d，并于第5天腹腔注射Cy 50mg/kg。第9天測(cè)定各項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)。
1.2.2 脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力的測(cè)定[5] 無(wú)菌取脾，置于盛有Hank's液的平皿中研磨過(guò)濾，除去結(jié)締組織、裂解紅細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)液重懸后進(jìn)行計(jì)數(shù)。將脾細(xì)胞濃度配成5×106/mL，加有絲分裂原ConA于96孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)不加ConA的對(duì)照孔，孵育68h。每孔加入10μL MTT作用4h，加細(xì)胞裂解液，在490nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度OD值。增殖反應(yīng)以ConA刺激指數(shù)SI表示，按下式計(jì)算：SI=實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值。
1.2.3 細(xì)胞因子的分泌水平測(cè)定 小鼠眼眶放血于Eppendorf管，將所取的小鼠血液于室溫靜置一段時(shí)間，分離血清后離心，-20℃保存待測(cè)。小鼠TNF-α、IFN-γ的檢測(cè)按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作，通過(guò)測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的OD值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線計(jì)算出細(xì)胞因子濃度。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 12.0 軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(±s)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異的比較。
2 結(jié)果
2.1 小鼠免疫抑制模型制備
與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞ConA刺激指數(shù)SI值和細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ的分泌水平均明顯降低(P
2.2 月見(jiàn)草花提取物對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響
與模型組比較，月見(jiàn)草花乙酸乙酯提取物中劑量組和水提取物中劑量組的ConA刺激指數(shù)SI值顯著增高(P
2.3 月見(jiàn)草花提取物對(duì)免疫抑制小鼠細(xì)胞因子分泌水平的影響(表1)
與模型組比較，月見(jiàn)草花中劑量乙酸乙酯提取物可明顯提高免疫抑制小鼠血清細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ分泌水平(P
3 討論
細(xì)胞免疫是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的一種重要免疫反應(yīng)，是機(jī)體抵抗細(xì)胞內(nèi)微生物如病毒和宿主細(xì)胞內(nèi)增生細(xì)菌感染的防御機(jī)制。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是測(cè)定機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)。本文結(jié)果顯示，兩種月見(jiàn)草花提取物中劑量組的小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞ConA刺激指數(shù)SI值與模型組比較均有不同程度的增高，表明月見(jiàn)草花兩種提取物能夠促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖，提示兩種提取物對(duì)免疫抑制小鼠的細(xì)胞免疫功能有增強(qiáng)作用，且中劑量乙酸乙酯提取物的作用較強(qiáng)。
在測(cè)定TNF-α和IFN-γ分泌水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，中劑量的月見(jiàn)草花乙酸乙酯提取物可顯著增加環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠TNF-α和IFN-γ分泌水平，中劑量的月見(jiàn)草花水提取物可提高TNF-α的分泌水平;月見(jiàn)草花乙酸乙酯提取物與水提取物相比，對(duì)小鼠TNF-α分泌水平的調(diào)節(jié)作用更好一些。表明月見(jiàn)草花兩種提取物對(duì)小鼠的TNF-α和IFN-γ分泌具有不同程度的上調(diào)作用，而TNF-α和IFN-γ分泌水平提高會(huì)對(duì)小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫功能產(chǎn)生影響。在體內(nèi)，細(xì)胞因子互相影響和制約，以網(wǎng)絡(luò)形式發(fā)揮效應(yīng)，月見(jiàn)草花提取物能提高局部微環(huán)境中TNF-α和IFN-γ分泌水平升高，IFN-γ和IL-12能促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，Th1細(xì)胞通過(guò)分泌IFN-γ、IL-2和TNF-β，增強(qiáng)機(jī)體T細(xì)胞免疫。提示月見(jiàn)草花提取物可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞因子的分泌水平發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。
從本次的研究結(jié)果看，中劑量的兩種月見(jiàn)草花提取物均可明顯增強(qiáng)ConA 刺激的免疫抑制小鼠T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，同時(shí)，免疫抑制小鼠的TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌水平也明顯提高?？梢哉J(rèn)為，兩種月見(jiàn)草花提取物對(duì)免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫具有積極的調(diào)節(jié)作用，并且乙酸乙酯提取物的作用效果明顯優(yōu)于水提取物。本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)月見(jiàn)草花不同提取物對(duì)免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的初步探討，為全面了解月見(jiàn)草花對(duì)機(jī)體免疫功能的影響，尚需要采用多種動(dòng)物模型來(lái)研究和證實(shí)月見(jiàn)草花的免疫調(diào)節(jié)作用，展開(kāi)其免疫調(diào)節(jié)作用的相關(guān)研究，探究其作用機(jī)理，并進(jìn)一步開(kāi)展月見(jiàn)草花有效成分的確定及作用機(jī)制的研究，闡明其藥理作用的分子機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系。
參考文獻(xiàn)
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【摘要】 研究小葉女貞對(duì)免疫功能損傷小鼠T淋巴細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用。方法 以免疫功能損傷小鼠為研究對(duì)象，將實(shí)驗(yàn)鼠隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為生理鹽水（NS）對(duì)照組、環(huán)磷酰胺（Cy）對(duì)照組、Cy+小葉女貞水煎液（小劑量）組、Cy+小葉女貞水煎液（大劑量）組、Cy+女貞子水煎液組。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)鼠外周血T淋巴細(xì)胞（CD4+、CD8+）的百分率，計(jì)算CD4+/ CD8+比值，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)外周血IL2的含量。結(jié)果 小葉女貞小劑量組和大劑量組CD4+T細(xì)胞、CD4+/ CD8+、IL2的含量分別與環(huán)磷酰胺組比較均明顯增高，有顯著性差異（P＜0.01）；與生理鹽水對(duì)照組比較，小劑量組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）、大劑量組明顯增高，有顯著性差異（P＜0.01）；與女貞子對(duì)照組比較，小劑量組結(jié)果低，有顯著性差異（P＜0.01）、大劑量組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論 小葉女貞能使小鼠受損傷的免疫功能得到改善， 能提高CD4+T細(xì)胞的數(shù)量和IL2含量，對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用與劑量成正相關(guān)。小葉女貞對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)機(jī)制是促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分化、發(fā)育為成熟的CD4+T細(xì)胞，達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的作用。
【關(guān)鍵詞】 小葉女貞 小鼠 免疫功能損傷 T淋巴細(xì)胞免疫功能 調(diào)節(jié)作用
【Abstract】 Objective To explore the modulation effect and mechanism of ligustrum quihoui carr(LQC) on the immune function of T lymphocytes in mouse whose immune function was damaged.Methods Mice with impaired immune function were experimental animal ，and pided into five groups randomly，twelve mice in every group，the decoction of LQC acted as experimental sample ，using the Cyclophosphamide and 0.9% NaCl as the positive comparison sample and negative comparison sample respectively， LQC minor dose，major dose，and fructus ligustri lucidi，adding Cyclophosphamide respectively，The percentage of T lymphocytes（CD4+、CD8+） in the peripheral blood of the experimental mice was detected by flow cytometer ， then calculated the ratio of CD4+ to CD8+，the content of IL2 in the peripheral blood is examined by Denley.Results Contrast minor dose group and major dose group with Cyclophosphamide group respectively ， the result was that the content of CD4+T cell CD4+/CD8+ IL2 all improved dramatically ，with significant difference (P＜0.01).When drawing a parallel between 0.9% NaCl and minor dose group ，there was no significant difference (P＞0.05).But when compared with the major dose group，there was significant difference between them(P＜0.01). Compared with fructus ligustri lucidi ， in the minor dose group ，the curative effect was worse ，there was significant difference (P＜0.01). But in major dose group ，there was no significant difference between them (P＞0.05). Conclusion The immune function of the damaged mice were improved by LQC，which also could increase the quantity of CD4+T cell and the content of IL2. The dose of LQC was positively correlated with the modulation effect of LQC on the immune function.The mechanism of regulation of LQC on the immune function of T lymphocytes could be realized by promoting the differentiation of T lymphocytes and developing to be mature CD4+ T cells ，so that it can regulate the cell immune function of body.
【Key words】 ligustrum quihoui carr ( LQC)，mouse，impaired immune function，immune function of T lymphocytes，modulation effect
小葉女貞又叫小白蠟，為木犀科女貞屬植物小葉女貞（ligustrum quihoui carr，LQC) 的果實(shí)［1］，性涼、味苦，和女貞子屬于同科同屬植物。初步研究［2，3］表明，小葉女貞可使ConA激發(fā)的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)明顯增強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞因子IL2有促進(jìn)作用，能促進(jìn)IL1的分泌，調(diào)節(jié)骨髓造血功能。但小葉女貞對(duì)免疫功能損傷動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)作用未見(jiàn)報(bào)道。我們以免疫功能損傷小鼠為研究對(duì)象，以小葉女貞的水煎液為實(shí)驗(yàn)樣品，以女貞子的水煎液和生理鹽水為陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠外周血T淋巴細(xì)胞（CD4+、CD8+）的百分率，計(jì)算CD4+/ CD8+比值，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)IL2的含量。研究在病理狀態(tài)下，小葉女貞對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)、利用小葉女貞提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1. 1 藥品和試劑：小葉女貞和女貞子（由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房提供），環(huán)磷酰胺（購(gòu)于濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院西藥房）。Rat熒光單克隆抗體CD3PC5，CD4PE，CD8FITC；同型對(duì)照IgG2aPE、IgG2aFITC購(gòu)于美國(guó)CALTAG Laboratories公司。全血溶血試劑購(gòu)自美國(guó)Coulter公司。IL2試劑盒購(gòu)于深圳晶美生物工程有限公司。
1.1.2 動(dòng)物：健康BALB/C小鼠60只，體重18～22 g，雌雄不限，購(gòu)于北京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
1.1.3 儀器：FC500大型流式細(xì)胞儀、QPREP溶血制備儀均為美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)，Denley全自動(dòng)酶標(biāo)儀。
1.2 方法
1.2.1 樣品制備：取小葉女貞或女貞子400 g，加蒸餾水2 500 ml浸泡2 h，水煎，煮沸30 min，過(guò)濾，藥渣加水1 000 ml，二次水煎，取濾液（壓渣），合并水煎液，濃縮成400 ml，即為樣品水煎液。
1.2.2 動(dòng)物分組：將小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只。Ⅰ組為生理鹽水（NS）對(duì)照組，NS 0.2 ml/d， 皮下注射，共10 d，第8日起用NS灌胃，0.2 ml/（d·只），共7 d。Ⅱ組環(huán)磷酰胺（Cy）對(duì)照組，Cy 0.8 ml/d，皮下注射［20 mg/（kg·d）］，共10 d，第8日起用NS灌胃同Ⅰ組。 Ⅲ組為Cy+小葉女貞水煎液組（小劑量），注射Cy同Ⅱ組，第8日起胃飼小葉女貞水煎液0.2 ml/（d·只），共7 d。Ⅳ組為Cy+小葉女貞水煎液（大劑量）組，注射Cy同Ⅱ組，第8日起胃飼小葉女貞水煎液0.4 ml/（d·只），共7 d。Ⅴ組為Cy+女貞子水煎液組，注射Cy同Ⅱ組，第8日起胃飼女貞子水煎液0.2 ml/（d·只），共7 d。
1.2.3 標(biāo)本采集及處理：所有受試小鼠均摘取眼球取外周血，分別置于含EDTAK2防凝管和小塑料管中，室溫保存，在12 h內(nèi)檢測(cè)分析。
1.2.4 流式細(xì)胞儀分析：①首先用Flowcheck進(jìn)行光路和流路校準(zhǔn)，使所有熒光信號(hào)CV﹤2%。②在標(biāo)有同型對(duì)照的試管中分別加入CD3PC5單克隆抗體和IgG2aFITC和IgG2aPE同型對(duì)照試劑各5 μl，再加入正常小鼠K2EDTA防凝血100 μl（5×105 cells）混勻，室溫避光15 min后，在標(biāo)本制備儀上溶血、固定上機(jī)。以前向散射光（FSC）及側(cè)向散射光（SSC）設(shè)門(mén)（A）于淋巴細(xì)胞群（圖1），以CD3PC5及SSC設(shè)門(mén)（H）于CD3+細(xì)胞(圖2)，調(diào)節(jié)電壓使同型對(duì)照細(xì)胞位于陰性區(qū)（圖3、4）。③在標(biāo)有CD4、CD8的試管中分別加入CD3PC5和CD4PE及CD8FITC單克隆抗體各5 μl，分別加入各實(shí)驗(yàn)小鼠K2EDTA防凝血100 μl（5×105 cells）混勻，室溫避光15 min后，在標(biāo)本制備儀上溶血、固定上機(jī)，調(diào)節(jié)顏色補(bǔ)償，分析各組每一實(shí)驗(yàn)小鼠CD4+、CD8+細(xì)胞的百分率。計(jì)算CD4+/CD8+比值。
1.2.5 IL2的測(cè)定：嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，全自動(dòng)酶標(biāo)儀定量測(cè)定小鼠外周血IL2含量。
2 結(jié)果
2.1 實(shí)驗(yàn)各組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+ 、IL2測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。 表1 小葉女貞對(duì)免疫功能損傷小鼠T淋巴細(xì)胞和IL2的作用 注：*示分別與環(huán)磷酰胺組、高劑量組、女貞子組比較，P＜0.01；與鹽水對(duì)照組比較，P＞0.05。
#示分別與環(huán)磷酰胺組、低劑量組、鹽水對(duì)照組比較，P＜0.01；與女貞子組比較，P＞0.05。
各組指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，CD4+T細(xì)胞數(shù)、CD4+/ CD8+比值、IL2的五組均數(shù)方差分析分別為F=23.6、F=19.8、F=40.6，P均＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)鼠CD4+、CD8+結(jié)果 小葉女貞小劑量組（圖5），小葉女貞大劑量組（圖6）。
圖5
圖6
3 討論
本實(shí)驗(yàn)以免疫功能損傷小鼠為研究對(duì)象，以小葉女貞的水煎液為實(shí)驗(yàn)樣品，以女貞子的水煎液和生理鹽水為陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，研究了小葉女貞對(duì)免疫功能損傷小鼠T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制。研究結(jié)果顯示，小葉女貞水煎液能提高免疫功能損傷小鼠CD4+T細(xì)胞的數(shù)量和IL2含量，說(shuō)明小葉女貞能使受損傷動(dòng)物的免疫功能得到改善，并提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。小葉女貞低劑量組能將受損傷小鼠的免疫功能調(diào)節(jié)至與鹽水對(duì)照組相近的水平，對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用與劑量成正相關(guān)。小葉女貞與女貞子對(duì)照組比較，有相同的免疫調(diào)節(jié)作用。由于CD4+或CD8+T細(xì)胞是在胸腺內(nèi)發(fā)育、分化形成的成熟T淋巴細(xì)胞，T細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程更傾向于形成CD4+T細(xì)胞，在胸腺中以及在外周血的CD4+是CD8+T細(xì)胞的1～2倍，是T淋巴細(xì)胞免疫功能的重要標(biāo)志。IL2是T淋巴細(xì)胞從細(xì)胞周期G1期到S期生長(zhǎng)有關(guān)的主要細(xì)胞因子，是T細(xì)胞主要的自分泌生長(zhǎng)因子［4，5］。因此，小葉女貞對(duì)T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制可能是促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞的分化、發(fā)育、成熟。達(dá)到調(diào)節(jié)提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能的作用，這在治療動(dòng)物免疫性疾病方面有廣泛的應(yīng)用前景，并為進(jìn)一步研究、開(kāi)發(fā)、利用小葉女貞提供了理論依據(jù)。
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【關(guān)鍵詞】 缺鐵性貧血；淋巴細(xì)胞免疫表型； 流式細(xì)胞儀；骨髓細(xì)胞學(xué)檢查
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2015.14.009
Investigation of flow cytometry in examination of lymphocyte immunophenotyping in iron-deficiency anemia patients YANG Hong， MENG Yan， WANG Chao. Department of Inspection， Beijing Fengtai Hospital， Beijing 100070， China
【Abstract】 Objective To research the changes of lymphocyte immunophenotyping in iron-deficiency anemia （IDA） patients. Methods There were 30 iron-deficiency anemia patients （IDA group） and 30 healthy people （normal control group）， and they all received flow cytometry three-color direct immunofluorescent method for detection of lymphocyte immunophenotyping. Comparison was made on the peripheral blood lymphocyte immunophenotyping between the two groups. Results IDA group had much lower levels of CD3+、CD3+CD4+， and CD4+/CD8+ ratio in peripheral blood than the normal control group （P
【Key words】 Iron-deficiency anemia； Lymphocyte immunophenotyping； Flow cytometry； Marrow cytology examination
缺鐵性貧血是因機(jī)體鐵的需要量增加和鐵吸收減少， 使體內(nèi)儲(chǔ)存鐵耗盡而缺乏， 又未得到足夠的補(bǔ)充， 導(dǎo)致合成血紅蛋白的鐵不足而引起的貧血[1]。是人類(lèi)最常見(jiàn)的慢性疾病之一。淋巴細(xì)胞免疫表型是了解機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的狀態(tài)。在正常機(jī)體內(nèi)各淋巴細(xì)胞亞群的相互作用， 維護(hù)著機(jī)體正常的免疫功能， 當(dāng)淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時(shí)， 都可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂并發(fā)生一系列的病理變化[2]。淋巴細(xì)胞免疫表型的分析對(duì)一些疾病的診斷、治療、免疫功能重建、器官移植監(jiān)測(cè)等有重要的臨床意義[3]。流式細(xì)胞儀檢測(cè)缺鐵性貧血與淋巴細(xì)胞免疫表型的關(guān)系， 國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。現(xiàn)將本院2012年1月～2014年12月收治的30例IDA患者進(jìn)行了外周血淋巴細(xì)胞免疫表型（CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD4+/CD8+）的檢測(cè)， 并與正常人對(duì)照。現(xiàn)報(bào)告如下。
1 資料與方法
1. 1 一般資料 30例IDA患者作為IDA組， 男5例， 女25例， 年齡23～81歲， 中位年齡46.5歲。血紅蛋白48～92 g/L， 紅細(xì)胞（3.24～4.76）×1012/L， 網(wǎng)織紅細(xì)胞0.1%～1.0%， 外周血紅細(xì)胞呈小細(xì)胞低色素性改變。骨髓細(xì)胞學(xué)檢查示：骨髓增生明顯活躍-活躍， 粒/紅比值1.91～4.37， 紅系增生活躍， 以中晚幼紅細(xì)胞為主， 晚幼紅細(xì)胞核固縮明顯。成熟紅細(xì)胞大小不等， 以小者居多， 中心淡染區(qū)明顯擴(kuò)大。骨髓細(xì)胞鐵染色：外鐵（-）， 細(xì)胞內(nèi)鐵為0～13%， 骨髓報(bào)告：符合缺鐵性貧血骨髓象。血清鐵2.51～11.5 mol/L， 血清鐵蛋白3.15～12.4 ng/L。全部病例服用鐵劑治療有效。另選健康體檢者30例作為正常對(duì)照組， 其中男10例， 女20例， 為血常規(guī)、血清鐵、鐵蛋白各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)， 且無(wú)其他器質(zhì)性病變。兩組一般資料比較， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 具有可比性。
1. 2 儀器與試劑 采用美國(guó)BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀， 三色標(biāo)記McAb：CD3FITC/CD4PE/CD45PerCP、CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP、紅細(xì)胞裂解液、熒光校準(zhǔn)微球 calibrate 3 Beads均購(gòu)自美國(guó)BD公司。
1. 3 方法
1. 3. 1 樣品的制備 各管分別加入CD3FITC/CD4PE/CD45 PerCP、CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP熒光抗體20 μl， 再分別加入新鮮EDTA-K3抗凝外周血100 μl， 混勻， 室溫避光孵育 20 min， 加入 1∶9 配制的溶血素 2 ml， 避光 10 min。2000 r/min 離心5 min， 倒掉上清液， 加入 PBS 緩沖液 2 ml， 2000 r/min 離心5 min。去上清， 加入500 μl PBS混勻待測(cè)。
1. 3. 2 流式細(xì)胞儀測(cè)定 以熒光微球calibrite 3-colour校準(zhǔn)儀器補(bǔ)償、使儀器分辨率CV
1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P
2 結(jié)果
IDA組外周血中CD3+、CD3+CD4+及CD4+/CD8+比值顯著低于正常對(duì)照組（P
3 討論
3. 1 缺鐵性貧血是一種全球性疾病， 雖然隨著現(xiàn)代物質(zhì)生活條件的改善， 各種營(yíng)養(yǎng)缺乏性疾病已大為減少， 但缺鐵性貧血仍然是人們所面臨的威脅健康的一大難題[3]。為了了解缺血性貧血對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的影響， 本試驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀三色免疫標(biāo)記法觀察30例成人缺鐵性貧血外周血淋巴細(xì)胞免疫表型的變化， 總結(jié)出缺鐵性貧血主要影響機(jī)體的細(xì)胞免疫功能， 可引起細(xì)胞免疫功能障礙和免疫調(diào)節(jié)紊亂[4]。
3. 2 淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分， 在人體細(xì)胞免疫中發(fā)揮核心作用。T 細(xì)胞免疫主要通過(guò)T 細(xì)胞的增殖分化來(lái)實(shí)現(xiàn)， 這是一個(gè)消耗能量、依賴(lài)核酸及蛋白質(zhì)合成的復(fù)雜過(guò)程[5]。CD3+ CD4+ T 細(xì)胞是輔/誘導(dǎo)性T淋巴細(xì)胞（Th細(xì)胞）， 也是遲發(fā)性超敏反應(yīng)的啟動(dòng)者、促使B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的輔助細(xì)胞、抑制性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)細(xì)胞；CD3+CD8+ T 細(xì)胞是抑制性/細(xì)胞毒性T細(xì)胞（Ts細(xì)胞）， 是細(xì)胞毒性T 細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞， 也是抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的抑制性細(xì)胞； 當(dāng)CD4+/CD8+比值發(fā)生變化時(shí)， 可引起機(jī)體免疫功能降低[6]。從而影響淋巴細(xì)胞的增殖和分化， 使T淋巴細(xì)胞功能受損， 導(dǎo)致免疫功能低下和免疫調(diào)節(jié)紊亂[7]。
3. 3 缺鐵性貧血可對(duì)多系統(tǒng)造成危害， 但對(duì)免疫功能的具體影響具有爭(zhēng)議。Salaman 等[8]認(rèn)為， IDA 可影響人體整個(gè)免疫系統(tǒng)， 使特異性和非特異性免疫功能均下降； 本研究從機(jī)體免疫功能角度出發(fā)， 分析IDA 對(duì)人體免疫功能的影響， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)IDA 患者CD3+、CD3+CD4+T細(xì)胞比例減少、CD3+CD8+ T 細(xì)胞比例升高， 提示IDA影響T細(xì)胞的增殖分化， 導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能障礙和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂[9]。
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